【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药原料制备领域，具体的涉及一种经济环保、提取过程简单和无“三废”处理压力的溶菌酶制备方法。
技术介绍
1、溶菌酶(lysozyme)，即n-乙酰胞壁质聚糖水解酶(n-acetylmuramylglycanhydrolase)，是一种无毒、无副作用、专门作用于微生物细胞壁的水解酶，具有溶解细菌作用。溶菌酶又称细胞壁溶解酶(muramidase)，广泛地分布于自然界，是存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素。人体内溶菌酶存在于嗜中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞内，当上述细胞参与免疫反应或分解时，其含量明显升高。溶菌酶与抗体、补体、吞噬细胞等具有协同作用，是机体中参与非特异性体液免疫的杀菌物质之一。溶菌酶具有多种药理作用，可水解细菌细胞壁的成份并使细胞内酶释出，加速细菌死亡，故被视为一种有效的抗菌药，此外，溶菌酶还具有抗病毒、止血、消肿及恢复组织功能等作用。
2、溶菌酶广泛分布于各种生物组织及其分泌物中，其中蛋清中的溶菌酶含量较为丰富，约占0.35％～0.45％左右。因此，商品化溶菌酶的主要来源是鸡蛋清，且鸡蛋清源的溶菌酶为目前研究最广泛的溶菌酶之一。cn1844379a公开了一种溶菌酶的制备方法，但是其制备过程繁琐，共需10步；中间过程控制参数较多，涉及到溶液的部分都需要调节ph；中间过程需要析晶，且步骤(4)所述方法析晶效率低。cn101603038b公开了一种溶菌酶的制备方法，但是其制备溶菌酶过程中需要使用含磷的无机盐；两次超滤需要使用截留分子量不同的超滤膜，且两步超滤操作之间有层析及洗脱操作
技术实现思路
1、为了解决上述存在的技术问题，本专利技术提供一种溶菌酶的制备方法。本专利技术制备得到的溶菌酶收率高、纯度高、酶活性高，方法所涉及试剂不含氮、磷等无机盐，制备方法经济环保，提取过程简单，无“三废”处理压力，并且其能够高效去除杂蛋白。
2、本专利技术采用的技术方案是：一种溶菌酶的制备方法，包括如下步骤：
3、步骤1：树脂的活化；
4、步骤2：新鲜蛋清的预处理；
5、步骤3：用树脂吸附新鲜蛋清中的溶菌酶，分离树脂；
6、步骤4：去除杂蛋白，包括将步骤3分离后的树脂首先用纯化水清洗后，再用0.1mol/l的氯化钠溶液清洗20～50min；
7、步骤5：对步骤4获得的去除杂蛋白后的树脂进行洗脱，收集洗脱液；
8、步骤6：对洗脱液进行处理、浓缩和除盐；
9、步骤7：干燥。
10、进一步的，步骤6：对洗脱液进行处理、浓缩和除盐，具体为：调节洗脱液的ph为3～5；然后加入硅藻土搅拌，压滤；将所得压滤液进行超滤浓缩和除盐；向所得超滤液中再次加入硅藻土搅拌，压滤，得压滤液。
11、更进一步的，所述超滤浓缩和除盐，采用截留分子量为5000da的超滤膜。
12、进一步的，步骤1中，所述树脂为d152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。
13、更进一步的，步骤1：树脂的活化，具体为：将d152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂，首先用纯化水搅拌清洗至少五次，每次1～5min；然后用40～50℃纯化水搅拌清洗1～3h；再用1mol/l的盐酸搅拌1～2h，静置1～2h后用纯化水洗涤至中性；最后用质量百分浓度为3％的氢氧化钠溶液搅拌1～3h，静置过夜后用纯化水洗涤至中性。
14、进一步的，步骤2：新鲜蛋清的预处理，具体为：将新鲜蛋清，用1mol/l的盐酸调节ph为6～8。
15、更进一步的；调节ph为7.5。
16、进一步的，步骤3：用树脂吸附新鲜蛋清中的溶菌酶，分离树脂，具体为：将树脂浸泡在蛋清液中6～8h或将树脂和蛋清液混合搅拌6～8h，过滤分离树脂。
17、进一步的，步骤4：将步骤3分离后的树脂首先用纯化水清洗至少3次后，再用0.1mol/l的氯化钠溶液清洗至少1次，0.1mol/l的氯化钠溶液清洗30min。
18、进一步的，步骤5中，所述洗脱是，将步骤4获得的去除杂蛋白后的树脂用质量百分浓度为3％的氯化钠溶液通过浸泡或搅拌的方式进行洗脱。
19、进一步的，步骤7中，所述干燥选自冷冻干燥或喷雾干燥。
20、本专利技术的有益效果是：
21、1、本专利技术提供的方法，采用超纯水和3％的氯化钠溶液协同分步洗脱，可以超高效率较干净的除去杂蛋白。
22、2、本专利技术提供的方法，溶菌酶提取工艺绿色环保、仅用到盐酸、氢氧化钠和氯化钠，工艺中不涉及含磷、氮的无机盐或有机溶剂，可放大生产。
23、3、本专利技术提供的方法，溶菌酶提取工艺收率高、纯度高，所得溶菌酶活力高。
24、4、本专利技术提供的方法，提取过程环境要求低、试剂种类少、提取操作简单。
25、5、本专利技术提供的方法，使用超滤技术进行浓缩除盐，所用超滤膜包为同一型号，均为5000da的膜包，同一规格膜包进行连续两次超滤，降低工艺复杂程度。
26、6、本专利技术提供的方法，制备得到的溶菌酶收率本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤6：对洗脱液进行处理、浓缩和除盐，具体为：调节洗脱液的pH为3～5；然后加入硅藻土搅拌，压滤；将所得压滤液进行超滤浓缩和除盐；向所得超滤液中再次加入硅藻土搅拌，压滤，得压滤液。
3.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩和除盐，采用截留分子量为5000Da的超滤膜。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述树脂为D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。
5.根据权利要求4所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤1：树脂的活化，具体为：将D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂，首先用纯化水搅拌清洗至少五次，每次1～5min；然后用40～50℃纯化水搅拌清洗1～3h；再用1mol/L的盐酸搅拌1～2h，静置1～2h后用纯化水洗涤至中性；最后用质量百分浓度为3％的氢氧化钠溶液搅拌1～3h，静置过夜后用纯化水洗涤至中性。
6.根据权
7.根据权利要求1、2或3所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤3：用树脂吸附新鲜蛋清中的溶菌酶，分离树脂，具体为：将树脂浸泡在蛋清液中6～8h或将树脂和蛋清液混合搅拌6～8h，过滤分离树脂。
8.根据权利要求1、2或3所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤4：将步骤3分离后的树脂首先用纯化水清洗至少3次后，再用0.1mol/L的氯化钠溶液清洗至少1次，0.1mol/L的氯化钠溶液清洗30min。
9.根据权利要求1、2或3所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述洗脱是，将步骤4获得的去除杂蛋白后的树脂用质量百分浓度为3％的氯化钠溶液通过浸泡或搅拌的方式进行洗脱。
10.根据权利要求1、2或3所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤7中，所述干燥选自冷冻干燥或喷雾干燥。
...【技术特征摘要】
1.一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤6：对洗脱液进行处理、浓缩和除盐，具体为：调节洗脱液的ph为3～5；然后加入硅藻土搅拌，压滤；将所得压滤液进行超滤浓缩和除盐；向所得超滤液中再次加入硅藻土搅拌，压滤，得压滤液。
3.根据权利要求2所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩和除盐，采用截留分子量为5000da的超滤膜。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述树脂为d152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。
5.根据权利要求4所述的一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，步骤1：树脂的活化，具体为：将d152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂，首先用纯化水搅拌清洗至少五次，每次1～5min；然后用40～50℃纯化水搅拌清洗1～3h；再用1mol/l的盐酸搅拌1～2h，静置1～2h后用纯化水洗涤至中性；最后用质量百分浓度为3％的氢氧化钠溶液搅拌1～3h，静置过夜后用纯化水洗...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘继东，郭明，孟维旭，张伟晨，张晴宇，杨强，
申请(专利权)人：沈阳兴齐眼药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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