【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疟疾防治，涉及mcp-1重组蛋白在制备疟疾红内期全虫灭活疫苗免疫佐剂中的应用。
技术介绍
1、疟疾是危害最为严重的寄生虫病。2021年，全球84个流行国家共发生2.47亿例疟疾病例，死亡61.9万，全球40％人口生命安全受到威胁，而疫苗是防治疟疾最经济有效的手段之一。虽然世卫组织2021年向全球推荐首款疟疾疫苗rts,s/as01，但iii期临床结果证实，其保护率仍未达到有效疫苗标准，因此，目前仍未有一款高效疟疾疫苗问世。
2、根据疟原虫在宿主体内发育的不同阶段，疟疾疫苗主要分为肝期预防性疫苗、红内期治疗性疫苗以及蚊期传播阻断疫苗。其中，红内期治疗性疫苗可有效降低患者发病率与死亡率，同时起到预防和治疗的作用。然而，由于存在候选抗原多态性、免疫佐剂和递送系统不够优化等问题，红内期疟疾疫苗研制进展十分缓慢。
3、与红内期亚单位疫苗存在候选抗原多态性的巨大挑战相比，红内期全虫疫苗因其富含多种抗原表位易于产生有效免疫保护从而受到关注，其中，红内期全虫灭活疫苗(whole-killed blood-stage vaccine，wkv)具备容易制造且能够诱导保护性免疫的优点，但也存在需要高剂量感染疟原虫的红细胞(parasitized red blood cells，prbcs)作为免疫原的缺点，这引起了人们对其安全性和低免疫原性的担忧。wkv的有效免疫剂量通常为每剂疫苗至少需要1.5×107个红内期疟原虫的裂解产物，开发与wkv联合应用且与人类兼容的免疫佐剂，将有助于减少这一剂量从而优化wkv。关于w
4、目前，明矾(alum)和cpg作为免疫佐剂已被尝试运用到wkv疫苗中，然而，alum仅略微提高了prbcs裂解产物的免疫原性；cpg能够显著提高疟原虫特异性cd4+t细胞免疫应答，并将疫苗抗原剂量从108减少到103，但cpg作为人类免疫佐剂的使用尚未得到批准。因此，找到一种与人类兼容的新型免疫佐剂，降低抗原剂量同时能增强疫苗诱导的宿主th1或gc-tfh细胞效应，成为了wkv成功研制的关键。
技术实现思路
1、本专利技术主要关注新型免疫佐剂的筛查，并关注了一种人体中天然存在的单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，mcp-1)，其主要由单核-巨噬细胞分泌，广泛参与宿主应对感染、炎症和肿瘤等免疫机制；而mcp-1重组蛋白是一种由同源重组工程所生产的人工蛋白质，可发挥与mcp-1相同的生理功能，且mcp-1重组蛋白易于购买获得。本专利技术的目的在于提供mcp-1重组蛋白在制备疟疾红内期全虫灭活疫苗免疫佐剂中的应用。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、mcp-1重组蛋白作为免疫佐剂联合红内期全虫灭活抗原制备红内期全虫灭活疫苗(wkv)：预先制备红内期疟原虫裂解产物以提供红内期全虫灭活抗原，并将mcp-1重组蛋白与较低剂量(低于最低有效剂量1.5×107个)红内期疟原虫裂解产物联合制备成wkv。
4、所述wkv中mcp-1重组蛋白的使用剂量为每只小鼠给予3μg，红内期全虫灭活抗原的使用剂量为每只小鼠给予与1×106个红内期疟原虫等量的裂解产物；wkv的免疫方式为mcp-1重组蛋白与红内期全虫灭活抗原混匀注射，首次免疫采用皮下注射，间隔2周与4周后分别进行第2与第3次免疫，后两次加强针均改为腹腔注射方式。
5、所述mcp-1重组蛋白的氨基酸序列为：qpdavnapltccysftskmipmsrlesykritssrcpkeavvfvtklkrevcadpkkewvqtyiknldrnqmrsepttlfktasalrssaplnvkltrkseanasttfstttsstsvgvtsvtvn，如seq id no:1所示。
6、疟疾红内期全虫灭活疫苗中mcp-1重组蛋白溶液的使用浓度为50ng/μl，其制备步骤如下：开盖前快速离心使冻干粉沉底，严格使用100μl无菌超纯水对100μg mcp-1重组蛋白进行溶解，配制成1μg/μl浓度母液；预先使用1×pbs溶解牛血清白蛋白(bsa)并配制成质量浓度为0.1％的bsa溶液，进行过滤细菌处理；将100μl mcp-1重组蛋白母液加入到1900μl0.1％无菌bsa溶液中，稀释至50ng/μl mcp-1重组蛋白使用浓度，分装储存于-80℃。
7、疟疾红内期全虫灭活疫苗中疟原虫裂解产物的制备步骤如下：复苏疟原虫并以106个原虫/只腹腔注射给小鼠，待原虫率升至25％以上时(通常感染至第4或第5天)，取小鼠全血与肝素钠(所述肝素钠溶液的浓度为300u/ml，即2mg/ml，采用1×pbs溶解)混匀抗凝，离心，去除上清，沉淀用等体积1×pbs重悬，洗涤两遍；每0.2ml红细胞沉淀体积用2ml皂素(所述皂素溶液的质量浓度为0.5％，即0.5g/100ml，采用1×pbs溶解)重悬，37℃孵育20min以裂解红细胞释放出疟原虫；离心，去上清，沉淀用两倍体积1×pbs重悬，离心，重复洗涤两遍，并用1×pbs重悬，调整疟原虫浓度至2×106个/μl；-80℃冷冻2h，后于37℃融化30min，反复冻融3次以获得等量浓度的裂解产物；混匀，分装储存于-80℃。
8、优选的，所述疟原虫包括约氏疟原虫。
9、本专利技术的有益效果在于：
10、本专利技术提供了mcp-1重组蛋白在制备疟疾红内期全虫灭活疫苗免疫佐剂中的应用。mcp-1重组蛋白作为免疫佐剂，能在较低剂量抗原的条件下显著增强红内期全虫灭活疫苗(wkv)抗同种红内期疟原虫免疫保护。mcp-1重组蛋白可以增强疟原虫特异性th1细胞分泌ifn-γ(th1型细胞免疫应答)，而非th2型细胞免疫和gc-tfh细胞参与的体液免疫，进而增强宿主接种wkv后的免疫应答。因此，本专利技术提供的mcp-1重组蛋白可作为免疫佐剂制备成wkv，对于wkv安全性与低免疫原性的优化、疟疾疫苗成功研制及疟疾防治具有潜在临床应用价值。
11、本专利技术的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本专利技术的实践中得到教导。本专利技术的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
12、本专利技术的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.MCP-1重组蛋白在制备疟疾红内期全虫灭活疫苗免疫佐剂中的应用，其特征在于，所述疟疾红内期全虫灭活疫苗包括全虫灭活抗原和免疫佐剂MCP-1重组蛋白；所述全虫灭活抗原为红内期疟原虫裂解产物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疟疾红内期全虫灭活疫苗中MCP-1重组蛋白的使用剂量为每只小鼠给予3μg，红内期全虫灭活抗原的使用剂量为每只小鼠给予与1×106个红内期疟原虫等量的裂解产物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MCP-1重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疟疾红内期全虫灭活疫苗中MCP-1重组蛋白溶液的使用浓度为50ng/μL，其制备步骤如下：
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述红内期疟原虫裂解产物的制备步骤如下：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肝素钠溶液的浓度为300U/mL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述皂素溶液的浓度为0.5g/100mL。
8.根据权利要
...【技术特征摘要】
1.mcp-1重组蛋白在制备疟疾红内期全虫灭活疫苗免疫佐剂中的应用，其特征在于，所述疟疾红内期全虫灭活疫苗包括全虫灭活抗原和免疫佐剂mcp-1重组蛋白；所述全虫灭活抗原为红内期疟原虫裂解产物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疟疾红内期全虫灭活疫苗中mcp-1重组蛋白的使用剂量为每只小鼠给予3μg，红内期全虫灭活抗原的使用剂量为每只小鼠给予与1×106个红内期疟原虫等量的裂解产物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mcp-1重组蛋白的氨基酸序列如seqid no:1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：高源利，徐文岳，刘太平，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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