【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别涉及一种用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒、重组工程菌及其制备方法。
技术介绍
1、alpha-淀粉酶抑制蛋白，是一种重要的生物活性物质，在医疗健康领域具有显著的应用价值。alpha-淀粉酶抑制蛋白通过抑制alpha-淀粉酶的活性，能够减缓淀粉在口腔和小肠中的消化速率，从而降低食物的血糖生成指数（gi值），有助于控制血糖水平。这一特性使其成为糖尿病管理的有力工具，特别是对于那些需要控制餐后血糖波动的患者而言，alpha-淀粉酶抑制蛋白的作用更为重要。除了降血糖作用，alpha-淀粉酶抑制蛋白还具有减脂、改善靶细胞对胰岛素的敏感性、减缓胃排空速率等多重益处，这使得它们在体重管理和糖尿病代谢综合征的调节中具有潜在的应用前景。在食品工业中，alpha-淀粉酶抑制蛋白可作为功能性食品成分，帮助开发低gi食品，这对于糖尿病患者和健康意识高的消费者尤为重要。alpha-淀粉酶抑制蛋白可以减缓淀粉的消化，有助于延长饱腹感，从而在减肥和体重管理产品中发挥作用。此外，alpha-淀粉酶抑制蛋白在农业领域的应用也正在受到关注，例如用于提高作物的抗虫性和改进作物储藏稳定性。这些多方面的应用不仅展现了alpha-淀粉酶抑制蛋白在促进人类健康方面的潜力，也突显了其在食品工业和农业技术中的多样化应用。总的来说，alpha-淀粉酶抑制蛋白作为一种多功能生物活性物质，在医疗、食品及农业领域展现出广泛的应用前景，alpha-淀粉酶抑制蛋白通过多种机制带来的健康益处使其成为值得进一步研究和开发的目标。
2、研
3、因此，现有技术中使用浸提等物理方法从白芸豆中提取alpha-淀粉酶抑制蛋白的方式，具有alpha-淀粉酶抑制蛋白产量较低的技术缺陷。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出一种用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒、重组工程菌及其制备方法，旨在解决现有技术中使用浸提等物理方法从白芸豆中提取alpha-淀粉酶抑制蛋白的方式，具有alpha-淀粉酶抑制蛋白产量较低的技术缺陷。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术公开了一种用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，包括：第一重组质粒和/或第二重组质粒；第一重组质粒含有第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白编码基因；第二重组质粒含有第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白编码基因。
4、所述第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通过白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因经过第一密码子优化得到，所述第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq idno.2所示。
5、所述第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通过白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因经过第二密码子优化得到，第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq idno.3所示。
6、白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因来源于白芸豆提取物，白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq id no.1所示。
7、第二方面，本专利技术公开了一种重组工程菌，包括：第一重组工程菌和/或第二工程菌；所述第一重组工程菌含有如上所述的第一重组质粒，所述第一重组工程菌包括如seqid no.2所示的核苷酸序列；所述第二重组工程菌含有如上所述的第二重组质粒，所述第二重组工程菌包括如seq id no.3所示的核苷酸序列。
8、第三方面，本专利技术公开了一种用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组工程菌的制备方法，包括：
9、s1.设计白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因特异性引物，并使用白芸豆基因组cdna作为模板进行pcr反应；扩增后的产物经过凝胶电泳和dna测序进行验证，得到白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi)；
10、s2.使用软件工具对白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi)分别针对大肠杆菌表达系统进行第一密码子优化得到第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)、针对枯草芽孢杆菌表达系统进行第二密码子优化得到第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)；
11、s3.设计引物，在第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)和pet28a载体上引入第一酶切位点，在第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)和phy-p43载体上引入第二酶切位点；
12、s4.利用双酶切法在第一酶切位点分别将第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)和pet28a载体打开；利用双酶切法在第二酶切位点分别将第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)和phy-p43载体打开；
13、s5.用连接酶将打开的第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi01)与pet28a载体连接，构建第一重组质粒(pet28a-pasi01)，随后使用热激法将第一重组质粒转化到表达载体escherichia coli rosetta(de3)之上；
14、s6.用连接酶将打开的第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi02)与phy-p43载体连接，构建出第二重组质粒(phy-p43-pasi02)，随后使用电转法将第二重组质粒转化到表达载体bacillus subtilis wb800n之上；
15、s7.将s5及s6中培养的菌液稀释后分别涂布在卡那霉素抗性培养基上，挑取阳性转化子，分别得到第一重组工程菌(de3-pet28a-pasi01)、第二重组工程菌(wb800n-phy-p43-pasi02)；
16、s8.将第一重组工程菌(de3-pet28a-pasi01)、第二重组工程菌(wb800n-phy-p43-pasi02)分别接种于lb培养液中，摇菌扩繁至对数期时加入iptg诱导表达。
17、优选的，白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因(pasi)分别针对大肠杆菌表达系统进行第一密码子优化，其中，密码子偏好性参考大肠杆菌k12mg1655，将ccc、gg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于表达白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，包括：第一重组质粒和/或第二重组质粒；
2.根据权利要求1所述用于表达白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，所述第一白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通过白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因经过第一密码子优化得到，所述第一白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述用于表达白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，所述第二白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通过白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因经过第二密码子优化得到，第二白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述用于表达白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因来源于白芸豆提取物，白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种重组工程菌，其特征在于，包括：第一重组工程菌和/或第二工程菌；>
6.一种用于表达白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组工程菌的制备方法，其特征在于，包括：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因分别针对大肠杆菌表达系统进行第一密码子优化，其中，密码子偏好性参考大肠杆菌K12MG1655，将CCC、GGG、GGA、AGG这几个大肠杆菌稀有密码子或低频使用密码子进行优化。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，白芸豆Alpha-淀粉酶抑制蛋白基因针对枯草芽孢杆菌表达系统进行第二密码子优化，其中，密码子偏好性参考Bacillus subtilis进行优化。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，第一酶切位点为BamHI和HindIII；第二酶切位点为BamHI和EcoRI。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S5及S6中，所述连接酶为T4 DNA连接酶。
...【技术特征摘要】
1.一种用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，包括：第一重组质粒和/或第二重组质粒；
2.根据权利要求1所述用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，所述第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通过白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因经过第一密码子优化得到，所述第一白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求2所述用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，所述第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因通过白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因经过第二密码子优化得到，第二白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq id no.3所示。
4.根据权利要求3所述用于表达白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白的重组质粒，其特征在于，白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因来源于白芸豆提取物，白芸豆alpha-淀粉酶抑制蛋白基因序列如seq id no.1所示。
5.一种重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文昭，廖家龙，龙俊儒，林佳纯，袁越，黄强，高楚涵，
申请(专利权)人：福瑞莱环保科技深圳股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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