【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学，具体涉及一种2-木糖醇脱氢酶突变体及其应用。
技术介绍
1、d-木酮糖(d-xylulose)，一种五碳糖，广泛存在于多种生物体内，在细胞能量生产和核酸合成的重要代谢过程中扮演着关键角色。此外，d-木酮糖也是合成多种稀有戊糖、生物乙醇以及新一代生物基材料糠醛(futfural)最为关键的原材料。目前，d-木酮糖的制备主要有以下路径：①利用木糖异构酶异构化d-木糖[1]，然而催化反应受异构酶内在热力学平衡的限制，d-木糖的理论转化率仅为40％左右，并且d-木糖与d-木酮糖的物理性质高度相似，后期分离成本高、收率低；②葡萄糖在耐高渗酵母的作用下转化为阿拉伯糖醇，然后采用醋杆菌属、葡萄糖杆菌或是克雷伯氏杆菌将阿拉伯糖醇氧化为d-木酮糖，转化率为20～95％，发酵时间长，时空产率低(cn102796797a、cn101486984a)；③d-木糖首先异构为d-木酮糖，d-木酮糖激酶选择性磷酸化d-木酮糖成d-木酮糖-5-磷酸，通过与异构酶的偶合从而可以拖动木糖的完全转化，体系需要能量atp再生系统，中间体、产物与副产物多次分离，总收率是61.1％(cn110616239a)；④从最基本有机原料之一的甲醛出发，利用生物酶法催化甲醛合成木酮糖[2]。通过苯甲酸脱羧酶催化甲醛聚合生成羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮(dha)。转醛醇酶进一步催化羟基乙醛和dha聚合生成木酮糖，最终实现甲醛到木酮糖的酶法转化。目前处于概念验证阶段，转化率为4.6％。
2、野生型菌株选择性氧化木糖醇c2位羟基合成d-木酮糖，但胞内2
3、参考文献
4、[1]pronk j t,bakker a w,van dam h e,et al.preparation of d-xylulosefrom d-xylose[j].enzyme and microbial technology,1988,10(9):537-542.
5、[2]崔博,卓炳照,逯晓云,等.酶法催化甲醛合成木酮糖[j].生物工程学报,2018,34(7):1128-1136.
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种耐受高浓度底物的2-木糖醇脱氢酶突变体，及其在制备高纯度d-木酮糖中的应用。
2、为实现上述目的，本专利技术利用分子对接和分子动力学模拟研究蛋白与底物结合模式。通过刻画高底物浓度(底物:蛋白浓度为40:1)下，木糖醇在蛋白表面及活性口袋的空间分布几率，选取了反应通道以及亚基界面参与典型非催化结合构象形成的共15个氨基酸残基。通过定点饱和突变和迭代饱和突变，筛选得到了2-木糖醇脱氢酶突变体f91y/f198v。该突变体f91y/f198v的氨基酸序列是在如seq id no：2所示的野生型2-木糖醇脱氢酶aipdh的氨基酸序列中第91位苯丙氨酸突变为酪氨酸、第198位的苯丙氨酸突变为缬氨酸。
3、本专利技术的另一目的是提供该2-木糖醇脱氢酶突变体的制备方法。
4、本专利技术的又一目的是提供该2-木糖醇脱氢酶突变体的应用。
5、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
6、来源于嗜热菌albidovulum inexpectatum野生型2-木糖醇脱氢酶aipdh的基因序列，如seq id no：1所示，经过定点饱和突变与迭代饱和突变筛选，获得该2-木糖醇脱氢酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no：3所示：
7、
8、
9、本领域技术人员应当知晓，表达本申请提供的2-木糖醇脱氢酶突变体的核酸分子中，除以上的核苷酸片段外，还可以包括如启动子、增强子、非编码区等核苷酸序列，以实现提高基因的表达量、表达效率、产物活性等方面性能的目的。
10、一种2-木糖醇脱氢酶突变体，氨基酸序列如seq id no：4所示：
11、
12、包含所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因的重组载体。其可通过本领域常规方法将本专利技术的2-木糖醇脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，重组质粒选自pet-22b(+)、pet-3a(+)、pet-3d(+)、pet-14b(+)、pet-15b(+)、pet-16b(+)、pet-17b(+)、pet-19b(+)、pet-20b(+)、pet-21a(+)、pet-23a(+)、pet-23b(+)、pet-24a(+)、pet-25b(+)、pet-26b(+)、pet-27b(+)、pet-28a(+)、pet-29a(+)，pqe2、pqe9、pqe30、pqe3 1、prset-a、prset-b、prset-c、pgex-5x-l、pgex-6p-l、pgex-6p-2、pbv220、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232-18、pbr322、puc-18或puc-19。更优选，上述重组质粒是pet-28a(+)。同时，为了在枯草芽孢杆菌中表达，优选地，可以使用的重组质粒选自pwb980、pht43、pbe2、pmutin4、pub110、pe194、pma5、pmk3、pmk4、pht304、phy300plk、pbest502、pdg1363、psg1154、pax01、psas144、pdl、pdg148-stu、pdg641、pucx05-bgab、pht01、pub110、ptz4、pc194、或更优选，上述重组质粒是pma5。
13、一种生产所述的2-木糖醇脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包含本专利技术所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因或本专利技术所述的重组载体。
14、所述的基因工程菌的宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌e.coli细胞或枯草芽孢杆菌。更优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)细胞。
15、一种催化剂，包含权利要求1所述的醇脱氢酶突变体；
16、可选地，所述催化剂选自：游离酶、游离细胞、固定化酶或者固定化细胞。
17、所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因、所述的重组载体、所述的基因工程菌在制备d-木酮糖中的应用。
18、一种2-木糖醇脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本专利技术所述的基因工程菌，获得重组表达的2-木糖醇脱氢酶突变体。...
【技术保护点】
1.一种2-木糖醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述2-木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第91位苯丙氨酸突变为酪氨酸、第198位的苯丙氨酸突变为缬氨酸的氨基酸序列。
2. 一种2-木糖醇脱氢酶突变体基因，其特征在于：所述2-木糖醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种包含权利要求2所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因的重组载体。
4.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含权利要求2所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因或权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。
6.一种催化剂，其特征在于，包含权利要求1所述的醇脱氢酶突变体；
7.权利要求2 所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4~5 中任一项所述的基因工程菌在制备2-木糖醇脱氢酶中的应用。
8.一种2-木糖醇脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：培
9.权利要求1所述的2-木糖醇脱氢酶突变体在转化木糖醇制备D-木酮糖中应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：催化反应体系是100~300 g/L的木糖醇、500 U~500 KU的2-木糖醇脱氢酶突变体、700 U~800 KU的NADH氧化酶和0.05~0.5 mmol/L的NAD+，在pH 7.5~9.0、反应温度30~55℃、搅拌转速180~1500 rpm以及通气量1~3 VVM或纯氧条件下反应2~36 h，得到D-木酮糖转化液。
...【技术特征摘要】
1.一种2-木糖醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述2-木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是seq id no：2所示的氨基酸序列的第91位苯丙氨酸突变为酪氨酸、第198位的苯丙氨酸突变为缬氨酸的氨基酸序列。
2. 一种2-木糖醇脱氢酶突变体基因，其特征在于：所述2-木糖醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
3.一种包含权利要求2所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因的重组载体。
4.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含权利要求2所述的2-木糖醇脱氢酶突变体基因或权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌bl21（de3）细胞。
6.一种催化剂，其特征在于，包含权利要求1所述的醇脱氢酶突变体；
7.权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：沙凤，孙科，谭芳美，
申请(专利权)人：苏州科宁多元醇有限公司，
类型：发明
国别省市：
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