【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物医学研究和临床诊断领域。特别地，本专利技术涉及使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法、用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置、使用定量相差显微镜检测细胞和/或分子生物对象的方法以及用于检测细胞和/或分子生物对象的装置。
技术介绍
1、常规的血细胞计数确定患者血样中红细胞、血小板、白细胞及其亚型的数目等参数，这些参数可用于诊断许多不同的疾病。最近的研究表明血细胞的聚集体如白细胞-血小板聚集体和白细胞聚集体也可用作多种病理学病症如心血管疾病和细菌或病毒感染的有用生物指标，参见例如m.finsterbusch et al.,platelets.2018nov；29(7):677-685,j.g.burel et al.,elife 2019；8:e46045，以及michelson et al,circulation.2001；104:1533-1537。
2、然而，血细胞聚集体的可靠检测是具有挑战性的，因为聚集体是易碎的对象并且可能容易崩解。这阻止了使用传统方法进行血液计数如米氏散射或基于荧光的流式细胞术的分析，这可能需要复杂且耗时的样品制备，包括红细胞的选择性裂解、细胞成分的染色和/或荧光标记。样品制备以及测量本身可影响细胞形态并可导致细胞聚集体的崩解，例如由于在离心或高流量(通常为1-10m/s)的流式细胞术中对其施加的机械力所致，这是对单个细胞进行足够统计的必要条件。
3、数字全息显微镜使用成像光束和参考光束之间的干涉来获得由样品透射的光的相位和振幅信息，并且例如允许重建样品的定
技术实现思路
1、因此，本专利技术的一个目的是提供允许快速和可靠地检测生物细胞和细胞聚集体并且适于在临床环境中进行自动化高通量分析的方法。
2、该目的通过使用根据权利要求1的定量相差显微镜的用于检测生物细胞的细胞聚集体的方法和根据权利要求19的用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置来实现。其实施方案在相应的从属权利要求中详细描述。
3、根据本专利技术的第一个方面，提供了使用定量相差显微镜检测生物细胞的细胞聚集体的方法。根据本专利技术第一个方面的方法包括从样品和粘弹性流体制备包括生物细胞的悬浮液。粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2mda至10mda的分子量，其中剪切稀化聚合物在悬浮液中的质量分数小于0.2％。该方法进一步包括沿微流体通道产生悬浮液的流，以将悬浮液中的细胞聚集体粘弹性聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。使用定量相差显微镜拍摄悬浮液中生物细胞的一个或多个相移图像，并识别一个或多个相移图像中的细胞聚集体。
4、所述方法可以例如使用根据下文所述根据本专利技术第一个方面的任何一个实施方案的用于检测生物细胞的细胞聚集体的装置来进行。样品可以是从患者提取的样品，尤其是液体样品，例如血液样品。因此，生物细胞例如可以是或包括血细胞，例如红细胞(红细胞)、白细胞(白细胞)和/或血小板(血小板)，和/或罕见细胞，例如循环肿瘤细胞和/或循环内皮细胞。
5、悬浮液可以通过将粘弹性流体添加到样品或从样品中提取的细胞中来制备，反之亦然。粘弹性流体是既具有粘性又具有弹性特性的流体，即可以表现出粘性流体的特性以及弹性固体的特性。粘弹性流体可以是非牛顿流体，其显示出取决于所施加的剪切速率的粘度，特别是剪切稀化流体，其显示出随着所施加的剪切速率而降低的粘度。粘弹性流体的粘弹性能可以至少部分地由其中包含的剪切稀化聚合物产生。粘弹性流体可以例如是包含剪切稀化聚合物的水溶液，例如由水或磷酸盐缓冲盐水和剪切稀化聚合物组成的溶液。
6、当产生悬浮液流时，粘弹性流体的粘弹性性质可导致包含在悬浮液中的物体(例如细胞和/或细胞聚集体)的粘弹性聚焦。流动中的物体例如可以向剪切速率低的区域迁移，例如悬浮液流动的中心区域，其中悬浮液具有最高的流速。在微流体通道中，这可以例如在微流体通道的两个相对侧壁之间的中心平面附近，或者在微流体通道的两对相对侧壁之间的中心线附近。
7、调整细胞和/或细胞聚集体在悬浮液流中的粘弹性聚焦，使得悬浮液中的细胞和/或细胞聚集体聚焦在定量相差显微镜的焦平面中。例如，粘弹性流体可导致细胞和/或细胞聚集体在悬浮液流动中心处，例如在微流体通道的中心平面或中心线附近的粘弹性聚焦。在一些实施方案中，微流体通道的中心平面和/或中心线可以位于定量相差显微镜的焦平面中。悬浮液中的细胞聚集体可以被聚焦，使得细胞聚集体的中心在垂直于显微镜的焦平面的方向上被限制在限制范围内。例如，至少90％的细胞聚集体，在一个实例中至少95％的细胞聚集体可以被限制在限制范围内。优选地，限制范围小于20μm，在一些实例中小于10μm，在一个实例中小于5μm。限制范围可以特别地等于或小于显微镜的景深的两倍，在一个实例中等于或小于显微镜的景深。在优选实施方案中，单个细胞也聚焦在显微镜的焦平面中，例如使得至少80％的单个细胞，在一些实例中至少90％的单个细胞，在一个实例中至少95％的单个细胞被限制在限制范围内。
8、用具有2mda至10mda的分子量、在悬浮液中的质量分数小于0.2％的剪切稀化聚合物的粘弹性聚焦可以允许细胞聚集体以及单细胞的可靠聚焦，同时降低细胞聚集体上的机械应力并防止聚合物诱导的细胞聚集。聚焦细胞聚集体，尤其是细胞聚集体和单个细胞的组合由于细胞聚集体和细胞可能具有的不同大小而具有挑战性。细胞聚集体的大小可以为例如1μm至50μm，而细胞的大小可以为1μm至20μm。例如，人血小板通常具有1μm至3μm的大小，而白细胞通常具有7μm至15μm的大小。作用在粘弹性流体中的对象上的力可以取决于对象的大小，使得不同大小的对象可以聚焦在不同点/位置本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.使用定量相差显微镜(108)检测生物细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A、102B)的方法(300)，所述方法(300)包括：
2.根据权利要求1所述的方法(300)，其中识别所述一个或多个相移图像中的细胞聚集体(102A、102B)包括确定单独的细胞聚集体(102A、102B)中的细胞的数目和/或单独的细胞聚集体(102A、102B)中的一些或全部细胞(104A、104B)的细胞类型。
3.根据权利要求2所述的方法(300)，其中确定单独的细胞聚集体(102A、102B)中的细胞的数目和/或单独的细胞聚集体(102A、102B)中的一些或全部细胞(104A、104B)的细胞类型包括：
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述方法(300)进一步包括识别所述一个或多个相移图像中的单个细胞(104A、104B)，以及确定所述单个细胞(104A、104B)的细胞类型。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物具有3.5MDa至4.5MDa的分子量。
6.根据前
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物是聚(环氧乙烷)或聚(乙烯基吡咯烷酮)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中选择所述悬浮液沿着所述微流体通道(202)的流速，使得所述流(208A)内的剪切应力低于50Pa，优选地低于10Pa。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中从所述微流体通道的入口到所述定量相差显微镜(108)的焦点的长度为30mm至60mm，优选35mm至50mm。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述悬浮液在垂直于所述定量相差显微镜(108)的所述焦平面的方向上的流(208A)的高度为30μm至100μm，优选40μm至60μm。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其进一步包括沿着所述微流体通道(202)产生两个或更多个鞘流(208B)以流体动力学地聚焦所述悬浮液的流(208A)，使得所述悬浮液中的细胞聚集体(102A、102B)聚焦在所述定量相差显微镜(108)的所述焦平面中。
12.根据权利要求11所述的方法(300)，其中所述两个或更多个鞘流(208B)中的一些或全部包括粘弹性流体。
13.根据权利要求11或12所述的方法(300)，其中通过在第一方向上产生夹住悬浮液的流(208A)的一对横向鞘流和在垂直于第一方向的第二方向(Z)上产生夹住悬浮液的流(208A)的一对垂直鞘流(208B)来流体动力学地聚焦悬浮液的流(208A)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述样品是全血样品或血液成分样品，并且识别所述一个或多个相移图像中的细胞聚集体(102A、102B)包括识别血小板聚集体(102A)和/或白细胞-血小板聚集体(102B)。
15.根据权利要求14所述的方法(300)，其进一步包括，在所述一个或多个相移图像中，确定包括两个或更多个白细胞(104B)的白细胞-血小板聚集体(102B)的数目和/或包含三个或更多个细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A、102B)的数目。
16.根据权利要求14或15所述的方法(300)，其中制备悬浮液包括分别将全血样品或血液成分样品按比例稀释，稀释比例为1:10至1:1000，优选1:50至1:200。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法(300)，其中制备所述悬浮液不包括红细胞的裂解、血小板和/或红细胞的球形化和/或细胞的标记或染色。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法(300)，其进一步包括添加血小板活化物质和/或白细胞活化物质以诱导血小板聚集和/或白细胞-血小板聚集。
19.装置(100)，其用于使用根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)检测生物细胞(104A、104B)的细胞聚集体(102A、102B)，所述装置(100)包括：
20.根据权利要求19所述的装置(100)，其中：
21.根据权利要求19或20所述的装置(100)，其进一步包括，样品制备单元(122)，其被配置成提供粘弹性流体，所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2MDa至10MDa的分子量，以从所述样品和所...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.使用定量相差显微镜(108)检测生物细胞(104a、104b)的细胞聚集体(102a、102b)的方法(300)，所述方法(300)包括：
2.根据权利要求1所述的方法(300)，其中识别所述一个或多个相移图像中的细胞聚集体(102a、102b)包括确定单独的细胞聚集体(102a、102b)中的细胞的数目和/或单独的细胞聚集体(102a、102b)中的一些或全部细胞(104a、104b)的细胞类型。
3.根据权利要求2所述的方法(300)，其中确定单独的细胞聚集体(102a、102b)中的细胞的数目和/或单独的细胞聚集体(102a、102b)中的一些或全部细胞(104a、104b)的细胞类型包括：
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述方法(300)进一步包括识别所述一个或多个相移图像中的单个细胞(104a、104b)，以及确定所述单个细胞(104a、104b)的细胞类型。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物具有3.5mda至4.5mda的分子量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物在所述悬浮液中的质量分数为0.03％至0.12％，优选0.04％至0.06％。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述剪切稀化聚合物是聚(环氧乙烷)或聚(乙烯基吡咯烷酮)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中选择所述悬浮液沿着所述微流体通道(202)的流速，使得所述流(208a)内的剪切应力低于50pa，优选地低于10pa。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中从所述微流体通道的入口到所述定量相差显微镜(108)的焦点的长度为30mm至60mm，优选35mm至50mm。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述悬浮液在垂直于所述定量相差显微镜(108)的所述焦平面的方向上的流(208a)的高度为30μm至100μm，优选40μm至60μm。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其进一步包括沿着所述微流体通道(202)产生两个或更多个鞘流(208b)以流体动力学地聚焦所述悬浮液的流(208a)，使得所述悬浮液中的细胞聚集体(102a、102b)聚焦在所述定量相差显微镜(108)的所述焦平面中。
12.根据权利要求11所述的方法(300)，其中所述两个或更多个鞘流(208b)中的一些或全部包括粘弹性流体。
13.根据权利要求11或12所述的方法(300)，其中通过在第一方向上产生夹住悬浮液的流(208a)的一对横向鞘流和在垂直于第一方向的第二方向(z)上产生夹住悬浮液的流(208a)的一对垂直鞘流(208b)来流体动力学地聚焦悬浮液的流(208a)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)，其中所述样品是全血样品或血液成分样品，并且识别所述一个或多个相移图像中的细胞聚集体(102a、102b)包括识别血小板聚集体(102a)和/或白细胞-血小板聚集体(102b)。
15.根据权利要求14所述的方法(300)，其进一步包括，在所述一个或多个相移图像中，确定包括两个或更多个白细胞(104b)的白细胞-血小板聚集体(102b)的数目和/或包含三个或更多个细胞(104a、104b)的细胞聚集体(102a、102b)的数目。
16.根据权利要求14或15所述的方法(300)，其中制备悬浮液包括分别将全血样品或血液成分样品按比例稀释，稀释比例为1:10至1:1000，优选1:50至1:200。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法(300)，其中制备所述悬浮液不包括红细胞的裂解、血小板和/或红细胞的球形化和/或细胞的标记或染色。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法(300)，其进一步包括添加血小板活化物质和/或白细胞活化物质以诱导血小板聚集和/或白细胞-血小板聚集。
19.装置(100)，其用于使用根据前述权利要求中任一项所述的方法(300)检测生物细胞(104a、104b)的细胞聚集体(102a、102b)，所述装置(100)包括：
20.根据权利要求19所述的装置(100)，其中：
21.根据权利要求19或20所述的装置(100)，其进一步包括，样品制备单元(122)，其被配置成提供粘弹性流体，所述粘弹性流体包括剪切稀化聚合物，所述剪切稀化聚合物具有2mda至10mda的分子量，以从所述样品和所述粘弹性流体制备包括生物细胞(104a、104b)的所述样品流体，其中所述剪切稀化聚合物在所述样品流体中的质量分数小于0.2％。
22.根据权利要求21所述的装置(100)，其中所述样品制备单元(122)被配置成将所述样品流体中的所述剪切稀化聚合物的质量分数调节为至少0.03％至0.12％，优选至少0％至0.2％。
23.根据权利要求21或22所述的装置(100)，其中所述样品制备单元(122)被配置成将所述样品流体按比例稀释，稀释比例为1:10至1:1000，优选1:50至1:200。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的装置(100)，其中所述样品制备单元(122)进一步被配置成将血小板活化物质和/或白细胞活化物质添加到所述样品流体和/或所述鞘流体中。
...
【专利技术属性】
技术研发人员：奥利弗·海登，克里斯蒂安·克林克，斯特凡·罗伊霍，
申请(专利权)人：慕尼黑科技大学，
类型：发明
国别省市：
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