【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于胆汁酸检测，具体涉及一种基于lc/ms/ms平台快速检测干血片或血清中17种胆汁酸的方法。
技术介绍
1、胆汁酸是一类二十四碳胆烷酸羟基衍生物的总称，由肝脏生成，经胆囊浓缩后在肠道内对脂肪代谢起着非常重要的作用。肝脏、胆囊和肠道的疾病会影响胆汁酸的代谢和转运，导致胆汁、血清和尿液中胆汁酸的变化，在临床上血清胆汁酸谱的测定可作为肝脏病变、肠道炎症、先天性胆道疾病和肝移植的诊断指标。但目前，国内外用干血片检测用于胆汁酸代谢异常相关疾病报道比较少，主要原因是常规检测方法的灵敏度无法满足干血片中胆汁酸谱的检测，且免疫法无法实现一针进样检测多种胆汁酸亚型，而超高效液相色谱串联质谱法(lc/ms/ms)的灵敏度高和可实现一针进样同时检测多种胆汁酸亚型的特点，才能满足干血片中多种胆汁酸亚型精准定量。
2、专利号为cn202111163684.3的专利：基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法，该专利提供一种基于lc-msms技术对血清中15种胆汁酸物质定量分析的方法，属于胆汁酸物质检测
，采用蛋白沉淀法处理血清样本后上lc-ms/ms，同时准确定量分析人血液成分中15种胆汁酸，但基质只是处理血清不涉猎干血片，蛋白沉淀法缺点是基质效应高，容易污染色谱柱前端而带来样本中本底基线太高，使得检测结果重现性差。专利号为cn202110787096.0的专利：一种基于lc-ms/ms法快速测定血清中41种胆汁酸含量的方法，该专利重点强调可以用lc-ms/ms的esi离子源实现41种胆汁酸的同时检测，但未
技术实现思路
1、为克服上述技术问题，本专利技术提供了一种基于lc/ms/ms技术快速检测干血片或血清中17种胆汁酸的方法。具体的说，本专利技术公开了一种用超滤管技术将干血片浸泡液或血清快速离心去除杂质，提取出17种胆汁酸目标物，并用lc/ms/ms检测技术实现一针进样同时检测17种胆汁酸化合物，并通过选用合适的流动相和液相色谱柱，对17种胆汁酸中3组同分异构体准确分离，有效定量。
2、本专利技术的目的可以通过以下方案来实现：
3、本专利技术提供了一种基于lc/ms/ms技术快速检测干血片或血清中17种胆汁酸的方法，所述方法包括以下步骤：
4、a1、样本前处理：向血清样本或干血片样本中加入氟化铵和混合内标的甲醇溶液，并进行超声提取，得到提取液；
5、a2、将步骤a1中得到的提取液转移至超滤管中，进行离心；
6、a3、取出超滤管，转移下层离心出来的提取液至96孔板中，上样lc/ms/ms进行检测，根据标准曲线得到血清样本或干血片样本中胆汁酸成分含量。
7、优选地，步骤a1中，所述干血片制备过程如下：在室温(23±2)℃、湿度60％±5％的环境下，取50μl全血滴在滤纸片上(直径12mm)，自然晾干约95分钟至完全干燥，再用直径2-12mm的打孔器从血片中心及周边部位(左上、右上、左下、右下)打孔后备用；其中血片为滤纸干血片，即干血片样本。
8、优选地，步骤a1中，所述滤纸干血片的片数为1-5片，直径为2-12mm。
9、在一些实施例中，滤纸干血片的片数为3片，直径为3mm。
10、进一步地，滤纸干血片打孔位置得到的直径3mm的滤纸片是均匀一致的样本，根据步骤a1样本前处理，在滤纸干血片不同打孔位置任意取3片直径3mm的滤纸片即可。
11、优选地，步骤a1中，所述血清的用量为20-80μl。
12、在一些实施例中，血清的用量为50μl。
13、本专利技术中，步骤a1将血清或干血片样本(滤纸片)、氟化铵溶液、内标溶液放入2ml离心管中进行超声提取。
14、优选地，步骤a1中，氟化铵和混合内标的甲醇溶液说明如下：先配制1mmol/l氟化铵甲醇溶液，然后将14种内标用1mmol/l氟化铵甲醇溶液配制成高浓度的混标溶液(浓度为400ug/ml)，然后再用1mmol/l氟化铵甲醇溶液稀释得到氟化铵和内标的甲醇溶液(内标浓度1ug/ml-40ug/ml)；所述14种胆汁酸内标种类如下：熊去氧胆酸(udca)-d4、胆酸(ca)-d4、去氧胆酸(dca)-d4、甘氨熊去氧胆酸(gudca)-d4、甘氨胆酸(gca)-d4、牛磺熊去氧胆酸(tudca)-d4、牛磺胆酸(tca)-d4、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)-d4、甘氨去氧胆酸(gdca)-d4、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)-d4、牛磺去氧胆酸(tdca)-d4、甘氨石胆酸(glca)-d4、石胆酸(lca)-d4、牛磺石胆酸(tlca)-d4。
15、优选地，步骤a1中，氟化铵和混合内标的甲醇溶液的浓度为1ug/ml-40ug/ml，添加量为100-200μl。
16、在一些实施例中，氟化铵和混合内标的甲醇溶液的浓度为1mmol/l，添加量为150μl。
17、优选地，步骤a1中，所述超声提取的时间为5-15分钟。
18、在一些实施例中，所述超声提取的时间为10分钟。
19、优选地，步骤a2中，所述离心的转速为10000-20000r/min，时间为5-15分钟，温度为室温。
20、在一些实施例中，所述离心的转速为14000r/min，时间为10分钟，温度为室温。
21、优选地，步骤a2中超滤管规格为1-3kd，0.1-1ml。
22、更优选的，步骤a2中，超滤管规格为3kd，0.5ml，超滤管套装在2ml的离心管内，通过高速离心可以将全部提取液过滤至2ml离心管里。
23、优选地，步骤a3中，检测的胆汁酸包括熊去氧胆酸(udca)、胆酸(ca)、鹅去氧胆酸(cdca)、去氧胆酸(dca)、甘氨熊去氧胆酸(gudca)、甘氨胆酸(gc a)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)、牛磺胆酸(tca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、甘氨去氧胆酸(gdca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)、牛磺去氧胆酸(tdca)、甘氨石胆酸(glca)、石胆酸(lca)、牛磺石胆酸(tlca)、甘氨猪去氧胆酸(th dca)、牛磺猪去氧胆酸(ghdca)。
24、优选地，步骤a3中转移出的提取液至700μl尖底的96孔板中，并盖上盖膜防止挥发，然后放入lc/ms/ms进样器中，进行检测。
25、优选地，步骤a3中，lc/ms/ms的17种胆汁酸的质谱参数如下表所示：
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28、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于LC/MS/MS技术快速检测干血片或血清中17种胆汁酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，胆汁酸有17种，具体包括：熊去氧胆酸UDCA、胆酸CA、鹅去氧胆酸CDCA、去氧胆酸DCA、甘氨熊去氧胆酸GUDCA、甘氨胆酸GCA、牛磺熊去氧胆酸TUDCA、牛磺胆酸TCA、甘氨鹅去氧胆酸GCDCA、甘氨去氧胆酸GDCA、牛磺鹅去氧胆酸TCDCA、牛磺去氧胆酸TDCA、甘氨石胆酸GLCA、石胆酸LCA、牛磺石胆酸TLCA、甘氨猪去氧胆酸THDCA和牛磺猪去氧胆酸GHDCA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A1中，所述氟化铵和混合内标的甲醇溶液的制备方法包括：先配制氟化铵甲醇溶液，然后将14种内标用氟化铵甲醇溶液配制成高浓度的混标溶液，然后再用氟化铵甲醇溶液稀释得到氟化铵和内标的甲醇溶液；所述14种胆汁酸内标包括：熊去氧胆酸UDCA-D4、胆酸CA-D4、去氧胆酸DCA-D4、甘氨熊去氧胆酸GUDCA-D4、甘氨胆酸GCA-D4、牛磺熊去氧胆酸TUDCA-D4、牛磺胆酸TCA-D4、甘氨鹅去
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A1中，所述干血片的制备过程如下：在23±2℃、湿度60％±5％的环境下，取全血滴在滤纸片上，自然晾干约至完全干燥，再用打孔器从血片中心及周边部位打孔后备用；其中血片为滤纸干血片，即干血片样本。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，滤纸干血片的片数为1-5片，直径为2-12mm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A2中超滤管规格为1-3KD，0.1-1ML。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A2中，所述离心的转速为10000-20000r/min，时间为5-15分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A3中，LC/MS/MS的17种胆汁酸的质谱参数如下表所示：
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A3中，LC/MS/MS的液相色谱的条件包括如下，加入0.1％氨水和5mM甲酸铵，将3组同分异构体分离，准确定量同分异构体亚型含量；
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A3中，所述校准曲线的制作方法包括：向校准品中加入氟化铵和混合内标的甲醇溶液，进行超声提取；再将提取液转入超滤管中进行离心，取下层提取液至96孔板中，上样LC/MS/MS进行检测，得到校准曲线。
...【技术特征摘要】
1.一种基于lc/ms/ms技术快速检测干血片或血清中17种胆汁酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，胆汁酸有17种，具体包括：熊去氧胆酸udca、胆酸ca、鹅去氧胆酸cdca、去氧胆酸dca、甘氨熊去氧胆酸gudca、甘氨胆酸gca、牛磺熊去氧胆酸tudca、牛磺胆酸tca、甘氨鹅去氧胆酸gcdca、甘氨去氧胆酸gdca、牛磺鹅去氧胆酸tcdca、牛磺去氧胆酸tdca、甘氨石胆酸glca、石胆酸lca、牛磺石胆酸tlca、甘氨猪去氧胆酸thdca和牛磺猪去氧胆酸ghdca。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a1中，所述氟化铵和混合内标的甲醇溶液的制备方法包括：先配制氟化铵甲醇溶液，然后将14种内标用氟化铵甲醇溶液配制成高浓度的混标溶液，然后再用氟化铵甲醇溶液稀释得到氟化铵和内标的甲醇溶液；所述14种胆汁酸内标包括：熊去氧胆酸udca-d4、胆酸ca-d4、去氧胆酸dca-d4、甘氨熊去氧胆酸gudca-d4、甘氨胆酸gca-d4、牛磺熊去氧胆酸tudca-d4、牛磺胆酸tca-d4、甘氨鹅去氧胆酸gcdca-d4、甘氨去氧胆酸gdca-d4、牛磺鹅去氧胆酸tcdca-d4、牛磺去氧胆酸tdca-d4、甘氨石胆酸glca-d4、石胆酸lca-d4、牛磺石胆酸tlca-d...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟立斐，俞辰，朱颢，谢晓磊，
申请(专利权)人：上海睿质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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