【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本文描述了用于通过strc基因疗法治疗听力损失、特别是与硬纤毛蛋白(stereocilin)(strc)突变相关的疾病形式的组合物和方法，其中strc基因的表达处于癌调蛋白(ocm)启动子的调控控制下。本公开提供了包括第一核酸载体和第二核酸载体的双载体表达系统，第一核酸载体含有编码硬纤毛蛋白n端部分的多核苷酸，第二核酸载体含有编码硬纤毛蛋白c端部分的多核苷酸。这些载体可用于增加细胞或受试者诸如患有听力损失(例如，感觉神经性听力损失)的受试者的野生型strc的表达或者向该细胞或受试者提供野生型strc。
技术介绍
1、感觉神经性听力损失是一类由内耳细胞或从内耳伸出到脑部的神经通路的缺陷引起的听力损失。尽管感觉神经性听力损失通常是后天性的，并且可能由噪音、感染、头部外伤、耳毒性药物或衰老引起，但也有与常染色体隐性突变相关的先天形式的感觉神经性听力损失。其中一种常染色体隐性感觉神经性听力损失与硬纤毛蛋白(strc)基因突变相关。硬纤毛蛋白是由染色体15q15上的strc基因编码的大蛋白质，其含有横跨基因组的约19kb的29个外显子。strc基因串联复制，其中第二个拷贝在第20个外显子中含有提前终止密码子，由此产生strc假基因。先前的研究已经鉴定出了患有常染色体隐性非综合征型感觉神经性听力损失的家族中的strc中的突变(verpy等人,nat.genet.29:345-9(2001))。硬纤毛蛋白的表达仅限于内耳毛细胞毛束中的硬纤毛。硬纤毛蛋白被认为形成水平的顶部连接体和盖膜附接冠，它们是听觉器官正常运作所必需的(avan等人,pna
2、近年来，治疗听力损失的努力越来越侧重于将基因疗法作为一种可能的解决方案；然而，strc基因太大而不允许使用标准的基因疗法途径进行治疗。需要新的疗法来治疗strc相关的感觉神经性听力损失。
技术实现思路
1、本专利技术提供用于治疗受试者诸如人受试者中的感觉神经性听力损失的组合物和方法。本公开的组合物和方法涉及用于向患有感觉神经性听力损失或有发展感觉神经性听力损失风险的受试者(例如，具有strc中的突变的受试者)递送编码硬纤毛蛋白的多核苷酸的双重载体系统。例如，使用本文所述的组合物和方法，可以通过病毒基因疗法向受试者递送第一核酸载体和第二核酸载体，该第一核酸载体和第二核酸载体各自编码功能性硬纤毛蛋白的一部分。本文所述的组合物和方法还可用于增加耳蜗毛细胞(例如，外毛细胞)中野生型硬纤毛蛋白的表达。
2、在第一方面，本专利技术提供一种双载体系统，其包含(a)第一核酸载体，该第一核酸载体包含癌调蛋白(ocm)启动子，该癌调蛋白(ocm)启动子与seq id no:1至seq id no:3中的任一个具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性，可操作地连接至编码硬纤毛蛋白n端部分的第一多核苷酸；以及(b)第二核酸载体，其包括编码硬纤毛蛋白c端部分的第二多核苷酸。
3、在一些实施方案中，第一多核苷酸与第二多核苷酸部分重叠。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸具有长度为至少200个碱基(b)(例如，至少200b、300b、400b、500b、600b、700b、800b、900b、1.0kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb或更多)的重叠区域。在这些实施方案中，当被引入哺乳动物细胞中时，第一核酸载体和第二核酸载体经历同源重组从而形成编码全长硬纤毛蛋白的经重组多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:43的核苷酸225至4574的序列。在一些实施方案中，第二核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:44的核苷酸211至4219的序列。
4、在一些实施方案中，第一核酸载体包括位于第一多核苷酸3'末端的剪接供体信号序列，并且第二核酸载体包括位于第二多核苷酸5'的剪接受体信号序列。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸不重叠。
5、在一些实施方案中，第一核酸载体包括位于第一多核苷酸3'末端的剪接供体信号序列和位于该剪接供体信号序列3'的第一重组发生区域，并且第二核酸载体包括第二重组发生区域、该重组发生区域3'的剪接受体信号序列和该剪接受体信号序列3'的第二多核苷酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸不重叠。在一些实施方案中，第一重组发生区域和第二重组发生区域相同。在一些实施方案中，第一重组发生区域和第二重组发生区域是ap基因片段。在一些实施方案中，ap基因片段包括seq id no:47至seq id no:52中任一个的序列或者由seq id no:47至seq id no:52中任一个的序列组成。在一些实施方案中，ap基因片段包括seq id no:50的序列或者由seq id no:50的序列组成。在一些实施方案中，第一核酸载体还包括位于重组发生区域3'的降解信号序列；并且第二核酸载体还包括位于该重组发生区域与剪接受体信号序列之间的降解信号序列。在一些实施方案中，第一核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:45的核苷酸225至4454的序列，并且第二核酸载体包括多核苷酸，该多核苷酸包括seq id no:46的核苷酸257至3597的序列。
6、在一些实施方案中，第二核酸载体还包括可操作地连接至第二多核苷酸、与seqid no:1至seq id no:3中任一个的核酸序列具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性的ocm启动子，其中该启动子位于第二多核苷酸的5'。在一些实施方案中，第二核酸载体中的ocm启动子与第一核酸载体中的ocm启动子相同(即，具有相同的核苷酸序列)。在一些实施方案中，第二核酸载体中的ocm启动子具有与第一核酸载体中的ocm启动子不同的核苷酸序列。
7、在一些实施方案中，第一核酸载体还包括位于第一多核苷酸3'的编码n端内含肽(n-内含肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，第二核酸载体还包括位于ocm启动子与第二多核苷酸之间的编码c端内含肽(c-内含肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，n-内含肽和c-内含肽是断裂内含肽反式剪接系统(split intein trans-splicing system)的组分。
8、在一些实施方案中，第一载体和/或第二载体包括内含肽降解信号。在一些实施方案中，降解信号是n-降解决定子和/或c-降解决定子。在一些实施方案中，n-降解决定子和/或c-降解决定子独本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双载体系统，其包含：
2.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸部分重叠。
3.如权利要求1或2所述的双载体系统，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸具有长度为至少200个碱基(b)的重叠区域。
4.如权利要求1至3中任一项所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体包含含有SEQID NO:43的核苷酸225至4574的序列的多核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的双载体系统，其中所述第二核酸载体包含含有SEQID NO:44的核苷酸211至4219的序列的多核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的双载体系统，其中当被引入哺乳动物细胞中时，所述第一核酸载体和第二核酸载体经历同源重组从而形成编码全长硬纤毛蛋白的经重组多核苷酸。
7.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体包含位于所述第一多核苷酸3'末端的剪接供体信号序列，并且所述第二核酸载体包含位于所述第二多核苷酸5'的剪接受体信号序列。
8.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体
9.如权利要求1、7和8中任一项所述的双载体系统，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸不重叠。
10.如权利要求8或9所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体包含含有SEQ ID NO:45的核苷酸225至4454的序列的多核苷酸，并且所述第二核酸载体包含含有SEQ ID NO:46的核苷酸257至3597的序列的多核苷酸。
11.如权利要求8至10中任一项所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体还包含位于所述重组发生区域3'的降解信号序列；并且其中所述第二核酸载体还包含位于所述重组发生区域与所述剪接受体信号序列之间的降解信号序列。
12.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第二核酸载体还包含可操作地连接至所述第二多核苷酸、与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一个的核酸序列具有至少85％序列同一性的OCM启动子，其中所述启动子位于所述第二多核苷酸的5'。
13.如权利要求1或12所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体还包含位于所述第一多核苷酸3'的编码N端内含肽(N-内含肽)的多核苷酸。
14.如权利要求12或13所述的双载体系统，其中所述第二核酸载体还包含位于所述OCM启动子与所述第二多核苷酸之间的编码C端内含肽(C-内含肽)的多核苷酸。
15.如权利要求12至14中任一项所述的双载体系统，其中所述N-内含肽和C-内含肽是断裂内含肽反式剪接系统的组分。
16.如权利要求15所述的双载体系统，其中所述断裂内含肽反式剪接系统衍生自一种或多种细菌的DnaE基因。
17.如权利要求1至16中任一项所述的双载体系统，其中所述OCM启动子与SEQ ID NO:1具有至少85％的序列同一性。
18.如权利要求1至17中任一项所述的双载体系统，其中所述双载体系统指导全长硬纤毛蛋白在哺乳动物OHC中的耳蜗外毛细胞(OHC)特异性表达。
19.如权利要求1至18中任一项所述的双载体系统，其中所述硬纤毛蛋白是与SEQ IDNO:4具有至少85％序列同一性的人硬纤毛蛋白，其中所述人硬纤毛蛋白由与SEQ ID NO:6具有至少85％序列同一性的多核苷酸编码。
20.如权利要求1至19中任一项所述的双载体系统，其中所述第一载体和所述第二载体是腺相关病毒(AAV)载体，并且其中所述AAV载体具有AAV1、AAV2、AAV2quad(Y-F)、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、rh10、rh39、rh43、rh74、Anc80、Anc80L65、DJ/8、DJ/9、7m8、PHP.B、PHP.eb或PHP.S衣壳。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1至20中任一项所述的双载体系统和药学上可接受的赋形剂。
22.一种人OHC，其包含权利要求1至20中任一项所述的双载体系统或权利要求21所述的药物组合物。
23.一种在人OHC中表达硬纤毛蛋白的方法，其包括使人OHC与权利要求1至20中任一项所述的双载体系统或权利要求21所述的药物组合物接触。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞在...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种双载体系统，其包含：
2.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸部分重叠。
3.如权利要求1或2所述的双载体系统，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸具有长度为至少200个碱基(b)的重叠区域。
4.如权利要求1至3中任一项所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体包含含有seqid no:43的核苷酸225至4574的序列的多核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的双载体系统，其中所述第二核酸载体包含含有seqid no:44的核苷酸211至4219的序列的多核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的双载体系统，其中当被引入哺乳动物细胞中时，所述第一核酸载体和第二核酸载体经历同源重组从而形成编码全长硬纤毛蛋白的经重组多核苷酸。
7.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体包含位于所述第一多核苷酸3'末端的剪接供体信号序列，并且所述第二核酸载体包含位于所述第二多核苷酸5'的剪接受体信号序列。
8.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体包含位于所述第一多核苷酸3'末端的剪接供体信号序列和位于所述剪接供体信号序列3'的第一重组发生区域，并且所述第二核酸载体包含第二重组发生区域、位于所述重组发生区域3'的剪接受体信号序列，以及位于所述剪接受体信号序列3'的所述第二多核苷酸。
9.如权利要求1、7和8中任一项所述的双载体系统，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸不重叠。
10.如权利要求8或9所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体包含含有seq id no:45的核苷酸225至4454的序列的多核苷酸，并且所述第二核酸载体包含含有seq id no:46的核苷酸257至3597的序列的多核苷酸。
11.如权利要求8至10中任一项所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体还包含位于所述重组发生区域3'的降解信号序列；并且其中所述第二核酸载体还包含位于所述重组发生区域与所述剪接受体信号序列之间的降解信号序列。
12.如权利要求1所述的双载体系统，其中所述第二核酸载体还包含可操作地连接至所述第二多核苷酸、与seq id no:1至seq id no:3中任一个的核酸序列具有至少85％序列同一性的ocm启动子，其中所述启动子位于所述第二多核苷酸的5'。
13.如权利要求1或12所述的双载体系统，其中所述第一核酸载体还包含位于所述第一多核苷酸3'的编码n端内含肽(n-内含肽)的多核苷酸。
14.如权利要求12或13所述的双载体系统，其中所述第二核酸载体还包含位于所述ocm启动子与所述第二多核苷酸之间的编码c端内含肽(c-内含肽)的多核苷酸。
15.如权利要求12至14中任一项所述的双载体系统，其中所述n-内含肽和c-内含肽是断裂内含肽反式剪接系统的组分。
16.如权利要求15所述的双载体系统，其中所述断裂内含肽反式剪接系统衍生自一种或多种细菌的dnae基因。
17.如权利要求1至16中任一项所述的双载体系统，其中所述ocm启动子与seq id no:1具有至少85％的序列同一性。
18.如权利要求1至17中任一项所述的双载体系统，其中所述双载体系统指导全长硬纤毛蛋白在哺乳动物ohc中的耳蜗外毛细胞(ohc)特异性表达。
19.如权利要求1至18中任一项所述的双载体系统，其中所述硬纤毛蛋白是与seq idno:4具有至少85％序列同一性的人硬纤毛...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·伯恩斯，M·施万德，X·吴，L·贝克尔，T·吉布森，N·潘，
申请(专利权)人：分贝治疗公司，
类型：发明
国别省市：
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