【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞、组织和类器官培养，特别涉及一种3d细胞培养板的制造方法及3d细胞培养板。
技术介绍
1、在现有体外细胞、组织和类器官培养技术中，培养方式分为悬浮培养和贴壁培养，后者又分为2d(平面)与3d(立体)培养。2d贴壁培养是在细胞扩增的常用的技术，但是，细胞在2d培养中难以模拟体内的3d环境，细胞与基质间的相互作用受限，同时细胞接受表面张力作用，可导致细胞的分化。为了克服这些弊端，研究人员开始采用更逼近体内环境的3d培养方法。与传统的2d细胞培养不同，3d细胞培养重现了细胞的体内环境，多层立体结构可以形成氧气、营养物质、代谢物和可溶信号的梯度，从而形成多样化的细胞群体、组织或器官。
2、目前，在3d细胞培养的技术中，通常采用两种方法，分别为无支架与含支架培养培养。无支架3d培养方法主要是让细胞自聚集形成球体，但是自聚集的细胞球大小不一，空间分布不均匀，各个孔之间的细胞球差异较大，导致高通量筛选的稳定性较差。而含支架的3d培养能够良好地模拟体内环境中细胞与细胞间的相互作用以及细胞与细胞外基质间的相互作用，同时允许细胞在支架上聚集、增殖、分化和迁移。
3、但是，不管是否含支架的3d培养板，在加入液体培养基后都会因毛细现象—孔壁表面对液体的黏附会使靠近壁面液体上升，形成凹液面(concave meniscus)，远离孔壁的液面与孔壁形成的夹角小于90度。因此会使得更多的细胞和培养基黏附在孔壁上，导致细胞在孔中央的细胞数量显著减少，而在孔边缘聚集。另外，由于液面不平，显微镜观察下成像模糊，尤其是用于高
4、针对凹液面的问题，现有技术中，有通过对孔壁表面进行涂层以改变接触角的方法来减少凹液面的形成或是在表面涂层的基础上增加了对孔板的设计，通过在孔中上半部分涂上疏水层，并把上半部分孔壁设计成锯齿状，从而进一步减小毛细现象形成的凹液面，但是在孔内无支架的情况下，细胞的成团方式都是自聚集，细胞球大小不一，空间分布不均匀，孔间差异较大，同时由于孔内不含支架，难以完成细胞的3d支撑。而在孔内设置支架对于细胞进行3d支撑时，由于支架本身形状难以控制导致细胞在支架中的位置各异，一方面不利于显微镜观察细胞，另一方面在培养孔的狭小空间内设置固定装置对于支架进行固定时，固定装置在与支架的连接处也会形成凹液面，使得细胞向固定装置聚集而难以成像，不利于使用。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术中细胞培养板中的培养孔内存在凹液面且不利于细胞培养的缺陷，提供一种3d细胞培养板的制造方法及3d细胞培养板。
2、本专利技术是通过下述技术方案来解决上述技术问题：
3、一种3d细胞培养板的制造方法，所述3d细胞培养板的制造方法用于制造细胞培养板，所述3d细胞培养板的制造方法具体包括以下步骤：
4、s1、分别配置用于制备支架的10％甲基丙烯酰化明胶与1.6％聚环氧乙烷溶液，将所述溶液按1:1混合，并涡旋5-20s；
5、s2、取细胞培养板，将浇注模具的限位环置入所述细胞培养板的培养孔中，将所述限位环与所述培养孔底部贴合，并使所述限位环的外周侧与所述培养孔的孔壁贴合，将所述限位环的顶部平齐设置，同时将所述限位环用于容纳所述支架的容纳腔内壁平齐设置，再将涡旋后的所述溶液根据所述限位环的顶部高度相平齐的预设值浇注于所述容纳腔中，振荡使所述溶液平铺；
6、s3、对所述容纳腔内的所述溶液进行光照使其形成支架并定型固化，将固化后的所述支架进行超声清洗，并取出所述限位环，之后将带有所述支架的所述细胞培养板置入冻干机中进行冻干，并在冻干结束后对于所述细胞培养板进行灭菌处理。
7、在本方案中，通过配置溶液使得支架在浇注后能够在自身内部形成供细胞培养的孔洞，对于溶液进行充分混合并涡旋进而在浇注之后使得支架中的孔洞分布更加均匀，在对于支架进行浇注前，需将限位环置入细胞培养板的培养孔中，通过限位环隔断容纳腔与培养孔的孔壁的连通关系，同时将限位环的顶部平齐设置，容纳腔的内壁也平齐设置，之后将溶液倒入容纳腔中进行支架浇注，需要注意的是支架的侧部通过容纳腔的内壁以保证平齐，支架的顶部通过注入容纳腔中的溶液量来保证与限位环的顶部相平齐，为使得支架能够适用于高通量筛选的细胞培养，而将溶液量根据预设值进行浇注，就可避免支架的顶部因浇注量不准确出现凹陷或突起。在浇注支架时可以辅助震荡的方式将溶液平铺，最后在对于溶液进行光照后使其固化形成支架，通过将限位环取出使得细胞培养板最终形成带有支架的细胞培养板，支架能够保证细胞培养时实现3d培养，同时，支架的顶部被设置为平齐能够使得细胞主要积聚在支架的中心区域，而支架又通过限位环直接成型于培养孔底部的中心区域，进而在对于扩增后的细胞进行观察时能够集中观察支架的中心区域，使得显微镜能够透过平齐的支架观察细胞培养情况，成像清晰且位置固定，相比于“凹液面”的情况来说，成像质量提高且对于高通量筛选时提供丰富样本，避免多个培养孔内的细胞无法被观察而影响高通量筛选的稳定性。
8、此外，支架在培养板底部中心区域直接固化成型，与底部贴合且有良好的黏附度。在方便运输的同时避免支架在培养孔内的位置发生变化，支架的侧部与培养孔的孔壁之间在限位环取出后形成间隙，该间隙可促进营养物质和代谢产物的交换，促进细胞生长。
9、较佳地，在步骤s3中具体还包括以下步骤：
10、s31、在所述支架定型固化后将所述支架的顶部以及侧部进行插孔和表面切削，在进行插孔以及表面切削后再将所述支架进行超声波清洗。
11、在本方案中，通过对于支架进行插孔，以将支架顶部或侧部平齐部分中的孔洞进行疏通，以提高细胞培养时进入支架内部的速度，插孔后对于表面进行切削进而始终保持支架的顶部和侧部平齐，通过采用超声波清洗的方式去除残留的碎屑，同时避免损坏支架。
12、较佳地，在步骤s1中具体还包括以下步骤：
13、s11、在配置所述溶液时通过调节所述甲基丙烯酰化明胶与所述聚环氧乙烷混合后的水凝胶前驱体溶液的冷冻速度来保持所述支架的孔洞的直径范围在50～400μm内。
14、在本方案中，通过调节前驱体溶液的冷冻速度来改变孔洞的直径，使得对于不同细胞亦或是组织、类器官进行培养时支架依然能够适用，提高细胞培养板的适用范围。
15、一种3d细胞培养板，所述3d细胞培养板采用上述所述的3d细胞培养板的制造方法制成，所述3d细胞培养板上阵列排布有多个培养孔，所述3d细胞培养板可用于高通量筛选细胞，所述培养孔内设置有支架，所述支架浇注于所述培养孔的底部的中心区域且与所述培养孔形成整体，所述支架通过浇注后形成用于细胞培养的孔洞，所述孔洞沿水平及竖直方向排列且设置于所述支架内，所述支架的顶部及所述支架的侧部平齐设置，且所述支架的侧部与所述培养孔的孔壁形成间隙，所述支架的顶部被设置为：当细胞及培养液注入所述支架时所述细胞及所述培养液在所述支架的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种3D细胞培养板的制造方法，所述3D细胞培养板的制造方法用于制造细胞培养板，其特征在于，所述3D细胞培养板的制造方法具体包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的3D细胞培养板的制造方法，其特征在于，在步骤S3中具体还包括以下步骤：
3.如权利要求1所述的3D细胞培养板的制造方法，其特征在于，在步骤S1中具体还包括以下步骤：
4.一种3D细胞培养板，其特征在于，所述3D细胞培养板采用权利要求1-3中所述的3D细胞培养板的制造方法制成，所述3D细胞培养板上阵列排布有多个培养孔，所述3D细胞培养板用于高通量筛选细胞，所述培养孔内设置有支架，所述支架浇注于所述培养孔的底部的中心区域且与所述培养孔形成整体，所述支架通过浇注后形成用于细胞培养的孔洞，所述孔洞沿水平及竖直方向排列且设置于所述支架内，所述支架的顶部及所述支架的侧部平齐设置，且所述支架的侧部与所述培养孔的孔壁形成间隙，所述支架的顶部被设置为：当细胞及培养液注入所述支架时所述细胞及所述培养液在所述支架的顶部各个位置相互平齐且均匀分布。
5.如权利要求4所述的3D细胞培养板，其特征在
6.如权利要求5所述的3D细胞培养板，其特征在于，所述浇注模具包括有限位环，所述限位环具有容纳腔，所述限位环的顶部平齐设置，所述容纳腔的侧壁平齐设置，所述支架被浇注于所述容纳腔内时浇注所述支架的溶液量根据与所述限位环的顶部高度相平齐的预设值浇注于所述容纳腔中。
7.如权利要求6所述的3D细胞培养板，其特征在于，所述浇注模具还包括有支撑条和连接臂，所述支撑条盖设于所述3D细胞培养板的顶部且覆盖所述培养孔，所述支撑条用于与所述3D细胞培养板的底板顶部卡合，所述连接臂的一端连接于所述限位环的顶部且远离所述容纳腔设置，所述连接臂的另一端连接于所述支撑条上。
8.如权利要求6所述的3D细胞培养板，其特征在于，所述限位环为永磁体。
9.如权利要求4所述的3D细胞培养板，其特征在于，所述孔洞的直径范围为50～400μm。
10.如权利要求4所述的3D细胞培养板，其特征在于，所述支架的材质为水凝胶，所述水凝胶包括1:1混合的甲基丙烯酰化明胶和聚环氧乙烷溶液，其中，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度范围为10％～20％，所述聚环氧乙烷的浓度范围为1％～2％。
...【技术特征摘要】
1.一种3d细胞培养板的制造方法，所述3d细胞培养板的制造方法用于制造细胞培养板，其特征在于，所述3d细胞培养板的制造方法具体包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的3d细胞培养板的制造方法，其特征在于，在步骤s3中具体还包括以下步骤：
3.如权利要求1所述的3d细胞培养板的制造方法，其特征在于，在步骤s1中具体还包括以下步骤：
4.一种3d细胞培养板，其特征在于，所述3d细胞培养板采用权利要求1-3中所述的3d细胞培养板的制造方法制成，所述3d细胞培养板上阵列排布有多个培养孔，所述3d细胞培养板用于高通量筛选细胞，所述培养孔内设置有支架，所述支架浇注于所述培养孔的底部的中心区域且与所述培养孔形成整体，所述支架通过浇注后形成用于细胞培养的孔洞，所述孔洞沿水平及竖直方向排列且设置于所述支架内，所述支架的顶部及所述支架的侧部平齐设置，且所述支架的侧部与所述培养孔的孔壁形成间隙，所述支架的顶部被设置为：当细胞及培养液注入所述支架时所述细胞及所述培养液在所述支架的顶部各个位置相互平齐且均匀分布。
5.如权利要求4所述的3d细胞培养板，其特征在于，所述3d细胞培养板还包括有浇注模具，所述浇注模具设置于所述间隙中且在所述支架成型后自所述培养孔内拆除，所述浇注模...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱海林，沈昊炜，陈慧敏，
申请(专利权)人：华夏司印上海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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