【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析检测，具体涉及一种阴极光电化学检测葡萄球菌肠毒素b的方法。
技术介绍
1、葡萄球菌肠毒素b(seb)作为一种毒素，广泛存在于受污染的沙拉、乳制品以及未冷藏的烘焙和肉类食品中[nodoushana,s.m.；nasirizadehb,n.；amania,j.；halabiana,r.；fooladia,a.a.i.biosens.bioelectron.2019,127,221–228]，会引起恶心、呕吐和腹痛等不同症状，甚至会引发中毒性休克综合征[ji,y.w.；li,x.；lu,y.l.；guo,p.l.；zhang,g.w.；wang,y.r.；zhang,y.；zhu,w.x.；pan,j.c.；wang,j.l.j.agric.food chem.2020,68,5959-5968]，其致死剂量为20ng/kg[nodoushana,s.m.；nasirizadehb,n.；amania,j.；halabiana,r.；fooladia,a.a.i.biosens.bioelectron.2019,127,221–228]。由于seb对食品安全及人类健康构成了重大威胁，因而需要开发一种简单、灵敏的方法用于seb的检测。目前检测seb的方法主要包括聚合酶链反应(pcr)[xu,y.；huo,b.；li,c.；peng,y.；tian,s.；fan,l.；bai,j.；ning,b.；gao,z.food chem.2019,283,338-344]、液相色谱-质谱法(lc-ms)[sospedra,i.；
2、光电化学(pec)具备操作简单、成本低、响应速度快、背景信号低、灵敏度高等特点[liu,t.l.；gu,m.m.；zhao,l.l.；wu,x.m.；li,z.j.；wang,g.l.chem.commun.2021,57,8989–8992]。相较于阳极pec，阴极pec具备更强的抗还原性物质干扰的能力，吸引了更加广泛的关注[wang,g.l.；yuan,f.；gu,t.t.；dong,y.m.；wang,q.；zhao,w.w.anal.chem.2018,90,1492–1497]。但其检测原理目前主要局限于光活性半导体材料到溶液中电子受体的光诱导电子转移(pet)机制，获得增强的阴极光电流，实现目标物的检测，信号转导策略单一，且阴极光电化学目前可利用的主要是溶解氧、亚甲基蓝、阿霉素、苯醌类化合物等响应分子，种类不够丰富。此外，尚未有工作报道将阴极光电化学用于seb的检测。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种分离式阴极光电化学检测葡萄球菌肠毒素b的方法，通过标记的碱性磷酸酶催化底物对氨基苯磷酸钠盐产生还原剂对氨基酚触发还原反应原位诱导碘氧化铋表面氧空位，在此基础上结合还原剂(如tcep等)介导的氧化还原循环反应，可以进一步还原对氨基酚的氧化产物重新生成对氨基酚，实现信号放大，获得增强的阴极光电流。
2、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
3、本专利技术提供一种阴极光电化学检测葡萄球菌肠毒素b的方法，包括以下步骤：
4、s1.将碘氧化铋(bioi)修饰于导电电极表面；
5、s2.将抗葡萄球菌肠毒素b二抗(ab2)、碱性磷酸酶(alp)与金纳米粒子(au nps)结合，形成含第一偶联物(二抗和碱性磷酸酶共同标记的金纳米粒子，ab2/au nps/alp)的产物；
6、s3.将抗葡萄球菌肠毒素b一抗(ab1)固定，加入含有不同浓度葡萄球菌肠毒素b(seb)的溶液，洗涤后向其中加入s2的产物，形成含第二偶联物(ab1/seb/ab2/au nps/alp)的产物；
7、s4.向s3的产物中加入对氨基苯磷酸钠盐，形成混合液，将s1的导电电极浸入所述混合液中进行反应，反应结束后将导电电极取出进行光电化学测试，测定光电流强度，制作光电流与葡萄球菌肠毒素b浓度的标准曲线；
8、s5.将待测溶液重复步骤s3～s4，将所得光电流数据代入标准曲线中，计算得到待测溶液中葡萄球菌肠毒素b的浓度。
9、本专利技术提供了一种新的光电化学检测机制，专利技术人创造性地发现，利用碱性磷酸酶(alp)催化底物对氨基苯磷酸钠盐(app)产生的还原剂对氨基酚(ap)，能够触发还原反应原位诱导碘氧化铋(bioi)表面氧空位(vo)，这是一种新的产生氧空位的策略。在此基础上，还能够引入化学反应的循环放大策略，结合还原剂(如tcep等)可以进一步还原ap的氧化产物重新生成ap，从而继续产生更多的氧空位，实现氧化还原循环信号放大，而表面反应诱导氧空位的产生可以导致光电流增强，实现对目标物的检测。本专利技术检测机制新颖，丰富了阴极光电化学信号转导机制的多样性。
10、基于以上发现的新的光电化学检测机制，本专利技术构建了一种分离式阴极光电化学免疫传感器，以alp作为标记物，seb作为目标物，将生物反应与光电化学检测分开进行，避免了光照对生物分子的破坏，并且阴极的电极光腐蚀会降低，提高了稳定性和对于还原性物质的抗干扰能力。同时，引入氧化还原反应介导的循环信号放大策略，可进一步提高检测的灵敏度，最终实现seb的灵敏检测。
11、进一步地，步骤s1中，所述bioi的制备方法包括以下步骤：将bi(no3)3·5h2o溶于有机溶剂中，加入ki溶液后进行水热反应，经过后处理得到所述bioi。
12、进一步地，所述bi(no3)3·5h2o和ki的摩尔比为1～2，优选摩尔比为1。
13、进一步地，所述水热反应的条件为在130～180℃下反应12～15h。
14、在具体实施方式中，将bi(no3)3·5h2o溶于乙二醇溶液中，在剧烈搅拌下将ki溶液缓慢滴加到上述溶液中，在130～180℃下进行水热反应12～15h，通过离心、洗涤后，置于60～70℃条件下干燥得到所述bioi。
15、进一步地，步骤s1中，将bioi分散于水中，制得bioi悬浮液，将bioi悬浮液滴涂于导电电极表面，所述碘氧化铋悬浮液的浓度为1.0～3.0mg/ml，干燥后得到碘氧化铋修饰的导电电极。
16、在具体实施方式中，所述导电电极经过预处理，具体操作为：将导电电极置于煮沸的异丙醇溶液中持续煮20～30min，随后用大量去离子水冲洗，并于120～130℃条件下烘干。
17、进一步地，步骤s1中，所述导电电极可选择氧化铟锡(ito)电极、氟掺杂氧化锡(fto)电极等。
18、进一步地，步骤s2中，所述抗葡萄球菌肠毒素b二抗、碱性磷酸酶与金纳米粒子结合体系的ph为8.0～9.0。
19、在具体实施方式中，在ph为8.0～9.0的金纳米粒子溶液中加入抗葡萄球菌肠毒素b二抗(ab2)和碱性磷酸酶。...
【技术保护点】
1.一种阴极光电化学检测葡萄球菌肠毒素B的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述碘氧化铋的制备方法包括以下步骤：将Bi(NO3)3·5H2O溶于有机溶剂中，加入KI溶液后进行水热反应，经过后处理得到所述碘氧化铋。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Bi(NO3)3·5H2O和KI的摩尔比为1～2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水热反应的条件为在130～180℃下反应12～15h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，将碘氧化铋分散于水中，制得碘氧化铋悬浮液，将碘氧化铋悬浮液滴涂于导电电极表面，所述碘氧化铋悬浮液的浓度为1.0～3.0mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述混合液中还包括还原剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述还原剂和对氨基苯磷酸钠盐在混合液中的浓度比为
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述混合液中还包括金属离子溶液和/或pH为9.0～10.0的缓冲溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述光电化学测试的测试缓冲液为pH为7.5的Tris-HAc缓冲溶液。
...【技术特征摘要】
1.一种阴极光电化学检测葡萄球菌肠毒素b的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述碘氧化铋的制备方法包括以下步骤：将bi(no3)3·5h2o溶于有机溶剂中，加入ki溶液后进行水热反应，经过后处理得到所述碘氧化铋。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述bi(no3)3·5h2o和ki的摩尔比为1～2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水热反应的条件为在130～180℃下反应12～15h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，将碘氧化铋分散于水中，制得碘氧化铋悬浮液，将碘氧化铋悬浮液滴涂于导电电极表...
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