【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及双光子显微成像，特别涉及轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法与装置。
技术介绍
1、双光子显微镜由于其在较深的生物组织内仍能保持良好的层析能力和高空间分辨率，目前已在脑科学、肿瘤等研究领域中获得了广泛的应用。
2、双光子荧光激发效应属于非线性光学现象，需要依赖飞秒激光光源结合物镜实现激光聚焦，才能在焦点处有效激发出双光子荧光，因此每个时间点仅获得焦点上的样品信息。目前结合共振扫描镜、声光偏转器、多面棱镜等高速快轴扫描器件，以及常规慢轴检流计振镜，进行二维点阵扫描(光栅扫描)，已能获得实时(10～30hz)的平面双光子成像，但结合轴向扫描的三维体成像方法待在持续优化发展过程中。
3、早些年，通过远程变焦器件或以压电陶瓷驱动物镜轴向快速移动的方式，可以做到以近实时速度(～10hz)将轴向2～4个层面进行连续切换成像。但这些早期方法的轴向层数较少，三维信息依然较少。
4、近年来，新出现的一些策略，如轴向脉冲分时复用、扩展焦深等，能有效地提高双光子体积成像的轴向层数与信息量。
5、如期刊文献”high-speed,cortex-wide volumetric recording ofneuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy”,jeffreydemas et al,nature methods,2021，使用轴向脉冲分时复用方法，在轴向范围内产生了30个焦点，相邻轴向焦点对应的脉冲
6、扩展焦深的方法是将激光焦点在轴向上拉长但横向尽量仍维持原样，形成类似针状的焦斑，拉长后多层的信息将投影在同一层，从而提高信息通量。通常使用贝塞尔光束或airy光束实现轴向拉长而保持横向分辨率。这种多层信息投影在同一层的方式，对于稀疏样品是很好，信息重叠率低，但对于较稠密的样品，信息重叠率将大幅上升，影响信息保真度。
7、近年来，扩展焦深法通过结合计算成像，通过进行多角度的投影成像，计算重建还原三维信息。通常采用双针状光束并行扫描，两光束呈一定夹角，如v型，或两光束形成轴向相反方向梯度光场，通过引入差别，结合重建算法，能有效计算重建出三维信息。如期刊文献”volumetric two-photon imaging of neurons using stereoscopy(vtwins)”,alexander song et al,nature methods,2017，在样品空间产生呈“v”布局的二根针状光束，同时进行扫描，相当于两角度的投影叠加，可通过反解计算还原重建三维图像。也可以不同时产生多角度针状光束，每一帧图像以其中一个角度进行投影，综合多帧多角度图像进行三维重建计算。如期刊文献”two-photon synthetic aperture microscopy forminimally invasive fast 3d imaging of native subcellular behaviors in deeptissue”,zhifeng zhao et al,cell,2023，进行13个角度的投影，每一帧进行其中1个角度，通过13帧图像重建还原出三维图像。
8、扩展焦深法结合三维重建计算，能显著增加或还原轴向信息量，但扩展焦深法所覆盖的轴向范围并不大，一般在100μm以内。因为同时覆盖的轴向范围越大，意味着焦深在轴向需要被拉长得更大，就越难于在横向上仍保持较高的分辨率。
9、如果能结合轴向脉冲分时多路复用法与扩展焦深法，两者的缺点能有效抵消：一方面扩展焦深法能覆盖一定轴向范围，并有效还原三维图像信息，意味着脉冲分时复用的数量能减少，从而减少对横向采样率的影响；另一方面，通过进行少量如4～8个焦点的轴向脉冲分时复用，能弥补扩展焦深覆盖范围有限的缺点，使轴向覆盖范围达到500μm以上。
10、但两者的结合存在困难，主要在于解决计算量大问题。因为扩展焦深结合投影三维重建，本身计算量较大，再加上脉冲分时各焦点信号的解调提取，也需要消耗巨大的计算资源，而且原来仅对100μm以内的图像信息做三维重建，现在需要对多段100μm以内的图像信息做三维重建，综合起来将产生巨大的实时计算量，单纯使用常规的gpu加速技术也难以做到实时处理与重建。其次，在光路布局上也需要一定优化处理。
技术实现思路
1、为了实现本专利技术的上述目的和其他优点，本专利技术的第一目的是提供一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，包括飞秒激光器、轴向脉冲分时多路复用模块、多角度投影的扩展焦深模块、二维双光子显微镜、中央控制与处理模块；所述中央控制与处理模块包括高速数据采集卡、逻辑芯片、图形处理芯片，所述高速数据采集卡、所述逻辑芯片、所述图形处理芯片依次通信连接，所述高速数据采集卡与所述二维双光子显微镜通信连接，所述飞秒激光器与所述逻辑芯片通信连接；
2、所述飞秒激光器发射飞秒脉冲激光并输入到所述轴向脉冲分时多路复用模块，所述轴向脉冲分时多路复用模块对输入的激光进行多路分束延时和引入变焦量，实现轴向脉冲分时复用功能，所述轴向脉冲分时多路复用模块输出的激光输入到所述多角度投影的扩展焦深模块，所述多角度投影的扩展焦深模块将焦斑在轴向上拉长，以及产生多角度的投影，所述多角度投影的扩展焦深模块输出的激光输入到所述二维双光子显微镜，所述二维双光子显微镜进行二维扫描成像、提供显微物镜实现聚焦以及荧光探测光电转换，荧光图像信号输入到所述中央控制与处理模块，所述高速数据采集卡对输入的信号进行采集，所述逻辑芯片对所述高速数据采集卡产生的高通量数据进行处理，结合所述飞秒激光器提供的脉冲同步信号进行各焦点数据的解调提取，并进行像素处理，然后将像素处理结果输入到所述图形处理芯片，所述图形处理芯片对输入数据进行处理，实现多角度投影图像的三维重建。
3、进一步地，所述轴向脉冲分时多路复用模块包括多个分束器、多个第一透镜、多个微型反射镜、第二透镜，飞秒脉冲激光通过多个所述分束器进行分束，然后分别经过不同延时量的光路长度，再分别经过各支路的所述第一透镜进行聚焦，在焦点附近，分别通过对应的所述微型反射镜进行反射，耦合到所述第二透镜。
4、进一步地，所述多角度投影的扩展焦深模块包括波前调制器、第三透镜、多角度产生器、第四透镜，输入激光先到达所述波前调制器本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：包括飞秒激光器、轴向脉冲分时多路复用模块、多角度投影的扩展焦深模块、二维双光子显微镜、中央控制与处理模块；所述中央控制与处理模块包括高速数据采集卡、逻辑芯片、图形处理芯片，所述高速数据采集卡、所述逻辑芯片、所述图形处理芯片依次通信连接，所述高速数据采集卡与所述二维双光子显微镜通信连接，所述飞秒激光器与所述逻辑芯片通信连接；
2.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述轴向脉冲分时多路复用模块包括多个分束器、多个第一透镜、多个微型反射镜、第二透镜，飞秒脉冲激光通过多个所述分束器进行分束，然后分别经过不同延时量的光路长度，再分别经过各支路的所述第一透镜进行聚焦，在焦点附近，分别通过对应的所述微型反射镜进行反射，耦合到所述第二透镜。
3.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述多角度投影的扩展焦深模块包括波前调制器、第三透镜、多角度产生器、第四透镜，输入激光先到达所述波前调制器，所述波前调制器对激光束进行像差波
4.如权利要求3所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述二维双光子显微镜包括两维光束扫描器、第五透镜、第六透镜、二向色镜片、物镜、红外截止片、第七透镜、光电倍增管、前置互阻放大器，所述两维光束扫描器使光束发生偏振，形成两维激光光栅扫描，然后通过所述第五透镜与所述第六透镜形成的4-f透镜组，将所述两维光束扫描器与所述物镜在光学上形成共轭关系，所述物镜将激光束聚焦在样品空间，所述二向色镜片和所述红外截止片将红外激光与可见光荧光的光谱分离，与激光分离后，荧光信号通过探测光路端的所述第七透镜，聚焦在所述光电倍增管的光阴极面上，经过光电转换产生光电流信号，光电流信号经过所述前置互阻放大器转换成幅度更大的电压信号，作为数据源输出到所述中央控制与处理模块。
5.如权利要求4所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述中央控制与处理模块与所述波前调制器、所述多角度产生器、所述两维光束扫描器、所述光电倍增管通信连接，所述中央控制与处理模块对所述波前调制器、所述多角度产生器、所述两维光束扫描器、所述光电倍增管进行参数设置以及生成扫描驱动波形曲线。
6.如权利要求3所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述波前调制器为液晶空间光调制器、可变性镜或数字微镜阵列。
7.如权利要求3所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述多角度产生器为被动的偏振分光的多棱镜元件或主动式的扫描器件。
8.如权利要求4所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述两维光束扫描器包括一维快轴扫描器和一维慢轴扫描器。
9.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述中央控制与处理模块还包括图像显示器、存储器，所述图像显示器、所述存储器与所述图形处理芯片通信连接，所述图像显示器对图像进行实时显示，所述存储器对数据进行存储。
10.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述逻辑芯片为FPGA，所述图形处理芯片为GPU。
11.一种如权利要求1～10任一项所述的装置的轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：包括飞秒激光器、轴向脉冲分时多路复用模块、多角度投影的扩展焦深模块、二维双光子显微镜、中央控制与处理模块；所述中央控制与处理模块包括高速数据采集卡、逻辑芯片、图形处理芯片，所述高速数据采集卡、所述逻辑芯片、所述图形处理芯片依次通信连接，所述高速数据采集卡与所述二维双光子显微镜通信连接，所述飞秒激光器与所述逻辑芯片通信连接；
2.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述轴向脉冲分时多路复用模块包括多个分束器、多个第一透镜、多个微型反射镜、第二透镜，飞秒脉冲激光通过多个所述分束器进行分束，然后分别经过不同延时量的光路长度，再分别经过各支路的所述第一透镜进行聚焦，在焦点附近，分别通过对应的所述微型反射镜进行反射，耦合到所述第二透镜。
3.如权利要求1所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述多角度投影的扩展焦深模块包括波前调制器、第三透镜、多角度产生器、第四透镜，输入激光先到达所述波前调制器，所述波前调制器对激光束进行像差波前校正，以及修饰物镜下焦斑形状或分布，经过所述第三透镜后光束聚焦并到达所述多角度产生器，所述多角度产生器产生多个角度的图像投影，最后激光经过所述第四透镜准直后输出。
4.如权利要求3所述的一种轴向脉冲分时复用结合扩展焦深的双光子成像装置，其特征在于：所述二维双光子显微镜包括两维光束扫描器、第五透镜、第六透镜、二向色镜片、物镜、红外截止片、第七透镜、光电倍增管、前置互阻放大器，所述两维光束扫描器使光束发生偏振，形成两维激光光栅扫描，然后通过所述第五透镜与所述第六透镜形成的4-f透镜组，将所述两维光束扫描器与所述物镜在光学上形成共轭关系，所述物镜将激光束聚焦在样品空间，所述二向色镜片和所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：周镇乔，吕晶，贾宏博，唐玉国，李敏，陈月岩，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。