【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表达il-15超级激动剂的溶瘤病毒的构建与应用，属于病毒微生物。
技术介绍
1、溶瘤病毒是一类在肿瘤细胞内选择性复制并发生溶瘤作用，在正常组织细胞中低复制或不复制，不发生细胞毒性作用的病毒统称。常见的溶瘤病毒主要有溶瘤腺病毒(adenovirus，adv)、单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus，hsv-1)、麻疹病毒(measlesvirus，mv)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)、痘苗病毒(vacciniavirus，vv)和新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)等。
2、近十多年来人们逐渐发现，溶瘤病毒不仅能够直接导致肿瘤细胞死亡(溶瘤)，还能够有效地打破肿瘤免疫耐受并诱导抗肿瘤免疫反应。越来越多的证据表明，溶瘤病毒的抗肿瘤作用主要依赖于其诱导的免疫溶瘤，而不是病毒的单纯溶瘤作用。溶瘤病毒诱导的免疫溶瘤作用，不仅是通过上调肿瘤局部的细胞因子和趋化因子来活化免疫细胞，更重要的是通过诱导肿瘤免疫原性细胞死亡(immunogenenic cell death，icd)，释放一类损伤模式相关分子(damage-associated molecular pattern molecues，damp)等危险信号，打破肿瘤微环境的免疫耐受，诱导免疫细胞对肿瘤细胞的识别与攻击。溶瘤病毒这种免疫溶瘤作用还能够通过多个途径增强抗原递呈细胞dc的功能，递呈“新抗原”给t细胞，活化并扩增肿瘤特异性t细胞，诱导特异性抗肿瘤免
3、细胞因子白介素15(interleukin 15，il-15)是一种多效性细胞因子，对调控记忆性cd8+t细胞和nk细胞分化，活化和增殖极其重要。与il-2相比，il-15不支持调节性t细胞(regulatory t cell，treg)维持和增殖。理论上使用il-15能够促进肿瘤特异性cd8+t细胞和nk细胞活化和增殖，杀伤肿瘤细胞，增强抗肿瘤免疫，具有肿瘤治疗作用。临床试验研究表明，静脉注射重组il-15能显著增加γδt细胞、cd8+t细胞和nk细胞的比例，但由于重组il-15半衰期短，高剂量il-15毒副作用明显，其抗肿瘤反应性有限。il-15活化il15受体需要先与单核细胞表面的il-15ra组装成二聚体再与t细胞或nk细胞表面的il-2/il-15rβ和γc结合才能激活il15受体，研究表明il-15ra的胞外区与il-15融合表达的il-15rail-15相比il15具有更强il15受体活化能力。il15的第72氨基酸n突变为d能显著提高il-15与其受体的亲和力，增强其活受体的能力。目前il-15超级激动剂已成为耀眼新星，研究数据表明它比il-2功能更强，但仍不能克服细胞因子在治疗中半衰期短、静脉给药副作用大的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种表达il-15超级激动剂的溶瘤病毒的构建方法与应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种表达il-15超级激动剂的溶瘤病毒，将il15rail15片段与vsv病毒基因组质粒连接得到的病毒全基因组质粒pt7-vsv-il15rail15；pt7-vsv-il15rail15与辅助质粒共转染至293t细胞，培养后获得vsv-il15rail15病毒种子；病毒种子使用293t细胞大量扩增得到溶瘤病毒vsv-il15rail15。
4、所述的表达il-15超级激动剂的溶瘤病毒的构建方法，具体包括以下步骤：
5、(1)il15rail15的设计：将il-15ra与突变的il-15使用linker序列连接融合成il15rail15，然后在il15rail15的n端加入cd33信号肽，c端加入6×his标签序列；
6、其中il-15ra的氨基酸序列为seq id no.1，突变的il-15氨基酸序列为seq idno.2，il15rail15的核苷酸和氨基酸的序列分别为seq id no.4、seq id no.5；
7、(2)溶瘤病毒vsv-il15rail15的克隆：以合成基因il15rail15为模板，通过pcr扩增获得il15rail15片段；pt7-vsv全基因组质粒使用xhoi和msci酶切后进行纯化，获得线性的pt7-vsv全基因，然后将il15rail15片段与病毒基因组质粒pt7-vsv连接，得到病毒全基因组质粒pt7-vsv-il15rail15；
8、(3)溶瘤病毒vsv-il15rail15的拯救：使用lipofectamine2000转染试剂将pt7-vsv-il15rail15与辅助质粒共转染至293t细胞，然后置于37℃5％co2细胞培养箱中培养96小时直至细胞病变，收集上清，获得vsv-il15rail15病毒种子；然后大量培养293t细胞，接种至平皿内，当细胞密度达到70-80％时，加入种子病毒后培养，至全部细胞病变后收集上清，即得到溶瘤病毒vsv-il15rail15，分装后置于-80℃保存。
9、所述步骤(3)中，pt7-vsv-il15rail15的用量为5μg，辅助质粒为pvrc-t7、pvrc-n、pvrc-p和pvrc-l，其用量均为500ng。
10、本专利技术还包括，所述的表达il-15超级激动剂的溶瘤病毒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
11、本专利技术的有益效果：
12、本专利技术使用体外重组技术构建了表达il-15超级激动剂(il15rail15)的溶瘤病毒vsv-il15rail15的全基因组质粒，利用反向遗传技术(病毒dna在体外改造(突变或插入新基因)后再制造的新病毒)获得表达il-15超级激动剂的溶瘤病毒vsv-il15rail15。
13、本专利技术的溶瘤病毒vsv-il15rail15在肿瘤局部表达il-15超级激动剂(il15rail15)与单纯的溶瘤病毒vsv和il15rail15治疗相比，能显著提高抗肿瘤作用。
14、本专利技术的溶瘤病毒vsv-il15rail15在肿瘤局部表达il15rail15，实现肿瘤局部的il15rail15高浓度分布，有效解决了il15rail15静脉给药半衰期短和毒副作用大等问题，能提高治疗的有效性与安全性。
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1.一种表达IL-15超级激动剂的溶瘤病毒，其特征在于，将IL15RaIL15片段与VSV病毒基因组质粒连接得到的病毒全基因组质粒pT7-VSV-IL15RaIL15；pT7-VSV-IL15RaIL15与辅助质粒共转染至293T细胞，培养后获得VSV-IL15RaIL15病毒种子；病毒种子使用293T细胞大量扩增得到溶瘤病毒VSV-IL15RaIL15。
2.一种权利要求1所述的表达IL-15超级激动剂的溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，pT7-VSV-IL15RaIL15的用量为5μg，辅助质粒为pVRC-T7、pVRC-N、pVRC-P和pVRC-L，其用量均为500ng。
4.一种权利要求1所述的表达IL-15超级激动剂的溶瘤病毒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种表达il-15超级激动剂的溶瘤病毒，其特征在于，将il15rail15片段与vsv病毒基因组质粒连接得到的病毒全基因组质粒pt7-vsv-il15rail15；pt7-vsv-il15rail15与辅助质粒共转染至293t细胞，培养后获得vsv-il15rail15病毒种子；病毒种子使用293t细胞大量扩增得到溶瘤病毒vsv-il15rail15。
2.一种权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张永辉，袁蒙蒙，刘广芝，李亚龙，张玉薇，程朝飞，应瑞琼，
申请(专利权)人：河南省人民医院，
类型：发明
国别省市：
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