【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、1,5-戊二胺(简称戊二胺，diaminopentane)，又被称为尸胺，是一种五碳二胺，可用作合成聚酰胺、聚氨酯或螯合剂的单体。作为重要的化学中间体，戊二胺在材料领域中可用作多种新型材料及高聚物的制备，在尼龙、涂料、粘合剂等方面具有广泛的应用前景。同时，由于戊二胺的生物特性，戊二胺在食品、农业及医药领域也有着重要的应用价值。
2、目前生物法生产戊二胺主要有两条途径：一种是酶法生产戊二胺，即用赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞来催化l赖氨酸生成戊二胺；另一种是选择合适的微生物，以葡萄糖为原料，直接发酵生产戊二胺。酶法生产戊二胺条件复杂，需要添加多种辅因子，而利用微生物直接发酵生产戊二胺成本低廉，有利于大规模生产。利用生物法转化可再生资源或废弃资源来生产戊二胺具有污染小、环境友好、可持续发展等优点。木质纤维素原料充足而廉价，如果能将之利用，不仅减少了农作物废物燃烧对大气的环境污染，也提高了农作物废弃物的经济价值，同时为能源紧缺提供一条可持续发展道路。
3、目前，微生物发酵生产戊二胺都以通过单一碳源为原料实现，葡萄糖与木糖的共利用技术还未发展全面。木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖。常见的木糖代谢途径主要是xr/xi/wbg以及dahms四种。emp作为基因工程菌株构建葡萄糖代谢模块的常用途径，常常与以上木糖代谢途径组合，构建木糖-葡萄糖共利用工程菌株。高效共利用木糖及葡萄糖的天
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，以解决葡萄糖分解代谢阻遏的问题，实现大肠杆菌对葡萄糖与木糖的同步利用发酵生产戊二胺，降低发酵成本，具有经济环保效益。
2、本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。
3、本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
4、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
5、一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，以大肠杆菌ka30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因cada、木糖异构酶基因xyla、木酮糖激酶基因xylb，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因ptsg，构建得到重组大肠杆菌nt1003-△ptsg-xylab-cada。
6、其中，所述的出发菌株——大肠杆菌ka30即为分类命名为大肠杆菌(escherichiacoli)的菌株，菌株号：nt1003△met△thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号：cctcc no：m 2013239。该菌株的详细信息已公开在专利cn103361289b中。
7、其中，所述的赖氨酸脱羧酶基因cada来源于大肠杆菌mg1655，其gene id：948643，对应的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的木糖异构酶基因xyla来源于大肠杆菌mg1655，其gene id：948141，对应的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述的木酮糖激酶基因xylb来源于大肠杆菌mg1655，其gene id：948133，对应的核苷酸序列如seq id no.11所示。
8、一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
9、(1)将赖氨酸脱羧酶基因cada通过同源重组的方式，以ncoi和hindiii为酶切位点，克隆到表达载体pcdftrc中，并验证，得到重组质粒pcdftrc-cada；
10、(2)将木糖异构酶基因xyla通过同源重组的方式，以ecori和bamhi为酶切位点，克隆到表达载体ptrc99a中，并验证，得到重组质粒ptrc99a-xyla；然后将木酮糖激酶基因xylb通过同源重组的方式，以bamhi为酶切位点，克隆到重组质粒ptrc99a-xyla中，并验证，得到重组质粒ptrc99a-xyla-xylb；
11、(3)敲除大肠杆菌ka30的葡萄糖特异性转运膜透性酶基因ptsg，获得表达宿主即敲除ptsg基因的大肠杆菌nt1003-△ptsg；
12、(4)将步骤(1)获得的重组质粒pcdftrc-cada和步骤(2)获得的重组质粒ptrc99a-xyla-xylb共同转化至步骤(3)获得的大肠杆菌nt1003-△ptsg中，得到重组大肠杆菌，即1,5-戊二胺生产菌株nt1003-△ptsg-xylab-cada。
13、其中，步骤(1)中，所述的表达载体pcdftrc为利用环化pcr将表达载体pcdfduet上的t7启动子更换为trc启动子，同时删除t7启动子后的操纵基因laco获得的改造载体。
14、其中，步骤(2)中，所述的表达载体ptrc99a为利用环化pcr删除ptrc99a启动子后的操纵基因laco获得的改造载体。
15、其中，所述的步骤(3)具体操作为：将cas9质粒导入目的菌株大肠杆菌ka30中，构建含有待敲除基因ptsg的n20序列的突变sgrna质粒、取待敲除基因ptsg两端序列作为基因敲除上下同源臂构建donor dna。然后将突变sgrna质粒、donor dna加至含有cas9质粒的目的菌株大肠杆菌ka30感受态细胞中，利用crispr-cas9基因编辑系统敲除基因ptsg，选取阳性转化子进行pcr验证成功后，将阳性菌株送测，再将测序正确的菌株于lb固体培养基连续传代培养直至其无法在有kanr以及smr抗性的固体lb培养基上生长，则敲除质粒脱除成功，最终获得敲除了ptsg基因的大肠杆菌nt1003-△ptsg；
16、上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用也在本专利技术所保护的范围之内。
17、其中，所述的应用，包括如下步骤：
18、(ⅰ)将活化后的重组大肠杆菌接种到种子培养基中进行种子培养，获得种子液；
19、(ⅱ)将步骤(ⅰ)将种子液直接接种于发酵培养基进行发酵培养。
20、其中，步骤(ⅰ)中，所述的种子培养，其培养条件为：37℃，180～250rpm培养至od600＝1.5～2，优选的其培养条件为：37℃，200rpm培养至od600＝1.5。
21、其中，步骤(ⅱ)，所述的接种，其接种量为2～5％v/v，优选的接种量为3％v/v；所述的发酵培养，其培养条件为：控制初始od600＝0.05～1，37℃下发酵30～36h，优选的培养条件为：控制初始od600＝0.05，37℃下发酵30～36h。
22、其中，步骤(ⅱ)，所述的发酵培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌KA30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，构建得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的赖氨酸脱羧酶基因CadA来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的木糖异构酶基因XylA来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的木酮糖激酶基因XylB来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的表达载体pCDFtrc为利用环化PCR将表达载体pCDFduet上的T7启动子更换为trc启动子，同时删除T7启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体；步骤(2
5.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，所述的种子培养，其培养条件为：37℃，180～250rpm培养至OD600＝1.5～2。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的接种，其接种量为2～5％v/v；所述的发酵培养，其培养条件为：控制初始OD600＝0.05～0.1，37℃下发酵30～36h。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其碳源为葡萄糖和木糖的组合；其中，所述的葡萄糖和木糖，其碳摩尔量比例为1～2:1。
10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其配方为：碳源22～23g/L，硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa 100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。
...【技术特征摘要】
1.一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌ka30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因cada、木糖异构酶基因xyla、木酮糖激酶基因xylb，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因ptsg，构建得到重组大肠杆菌nt1003-△ptsg-xylab-cada。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的赖氨酸脱羧酶基因cada来源于大肠杆菌mg1655，其核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的木糖异构酶基因xyla来源于大肠杆菌mg1655，其核苷酸序列如seq id no.6所示；所述的木酮糖激酶基因xylb来源于大肠杆菌mg1655，其核苷酸序列如seq id no.11所示。
3.一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的表达载体pcdftrc为利用环化pcr将表达载体pcdfduet上的t7启动子更换为trc启动子，同时删除t7启动子后的操纵基因laco获得的改造载体；步骤(2)中，所述的表达载体ptrc99a为利用环化pcr删除ptrc99a启动子后的操纵基因laco获得的改造载体。
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