【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种抗体定向标记生物素聚合物的方法。
技术介绍
1、抗体，也叫免疫球蛋白(ig)，是一种能特异性结合抗原的糖蛋白，而抗原是在易感染动物体内引发抗体产生的物质。在体内，抗体是由于外源性分子的侵袭而产生的。抗体以一个或者多个y字形单体存在，每个y字形单体由4条多肽链组成，包含两条相同的重链和两条相同的轻链。轻链和重链是根据它们的分子量大小来命名的。y字形结构的顶端是可变区，为抗原结合部位。
2、抗体的整体结构可分为以下部分：porter等对血清igg抗体的研究证明：ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即：由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的分子量较大的肽链(重链)组成。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(h)和两条非糖基化轻链(l)；每条重链和轻链分为氨基端(n端)和羧基端(c端)。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(h)和两条非糖基化轻链(l)；每条重链和轻链分为氨基端(n端)和羧基端(c端)。轻链由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量为24kd，有两个由链内二硫键组成的环肽，l链可分为：kappa(κ)与lambda(λ)2个亚型。重链由450-550个氨基酸残基组成，分子量55-75kd，含糖数量不同，4-5个链内二硫
3、可变区和恒定区：可变区的l链n端1/2处(vl)108-111个氨基酸残基，h链n端1/5-1/4处(vh)118个氨基酸残基，v区有一个肽环65-75个氨基酸残基。可变区可分为高变区(hypervariable region，hvr)和骨架区(framework region，fr)，vl的hvr在24-34，50-56，89-97氨基酸位置。vh的hvr在31-35，50-56，95-102氨基酸位置。分别称为vl和vh的hvr1，hvr2，hvr3。高变区为抗体与抗原的结合位置，称为决定簇互补区(complementarity-determining region，cdr)，vl和vh的hvr1，hvr2，hvr3又分别称为cdr1，cdr2，cdr3，其中cdr3具有更高的高变程度，h链在与抗原结合中起重要的作用。恒定区的l链c端1/2处，105个氨基酸残基，h链c端3/4-4/5处，331-431个氨基酸残基。在同一种属动物中是比较恒定的，是制备第二抗体进行标记的重要基础。
4、抗体目前广泛应用于医疗、体外诊断等多个领域，根据其应用场景及目的的不同，需对天然抗体或重组抗体进行进一步的修饰或与其他物质进行偶联。在诊断试剂领域，根据抗原抗体特异性反应用于不同待检物质的检测。抗体与相应标志物、载体的偶联技术是诊断试剂能够得以开发应用的前提。
5、其应用场景可分为以下几类：①抗体与酶(碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等)偶联，制备酶标抗体，用于诊断试剂信号物质的发光。②抗体与载体偶联，包括磁微粒、胶乳微球等载体。③抗体与小分子物质偶联，如荧光素、生物素、多肽类物质等。
6、生物素-亲和素系统(biotin-avidin-system，bas)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比活度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，bas具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。bas用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称ba法，或标记亲和素生物素法(lab)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为桥联亲和素-生物素法(brab)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与abc标记体系连成一体，称为abc法。这一方法可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。生物素-亲和素系统还可以用相似的方法分离dna，方法是在dna探针的一端挂上生物素，然后用其获得目的dna片段，再利用固定化的亲和素回收这些dna。
7、随着生物素衍生物种类增多，抗体的生物素化技术日益成熟。常用技术为是利用生物素表面的羧基与抗体表面氨基直接偶联，这种方法的优势是操作简便，标记效率高。根据抗体的结构、特性所建立的定向标记技术已广泛应用于各大领域。
8、目前常用技术是利用生物素及其衍生物与抗体表面氨基酸残基直接反应实现抗体生物素化，虽然技术成熟，操作简单，但其弊端是无法实现抗体定向标记，且容易出现非特异性吸附、特异性低、试剂稳定性差等情况。如果生物素与抗体活性区域氨基酸残基结合，会大大降低抗体亲和力与灵敏度。
9、另外，市面上也有利用醛基等基团进行标记，会使用硼氢化钠等吸入或者皮肤接触该试剂对人体有害的物质。利用抗体fc段糖链实现抗体的定向标记具有通用性，但生物素与抗体偶联效率比较低，导致生物素化抗体信号放大能力较差，产品试剂盒的稳定性差，灵敏度差，特异性不高。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，该方法是以生物素或其衍生物上的羧基与bsa的表面的氨基反应，反应结束后去除游离的生物素，然后得到生物素聚合物；利用还原剂将抗体的fc端二硫键断裂，轻微的还原导致在片段的中心部分将重链对结合在一起的二硫化物断裂，从而产生两个f(ab')片段，每个片段含有一个抗原结合位点，还原为重链二硫化物。去除非蛋白物质，得到巯基化抗体。加入异型双功能交联剂，得到修饰后的抗体复合物。取出冷冻保存的生物素聚合物，然后加入被修饰后的抗体复合物进行交联反应一段时间，得到生物素化抗体。
2、本专利技术的第二目的在于提供一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，该方法实现抗体定向标记生物素；提升生物素化抗体的亲和力；工艺时间短，步骤简单，工艺放大过程中风险点小，可控制，降本增效。该方案无需使用危险试剂，利用重组抗体fc端的基团，人工合成生物素聚合物，即可实现抗体定向标记生物素。该方法通用性强，适用范围广，获得的生物素化抗体亲和力强、特异性高、稳定性好。
3、本专利技术通过以下技术方案实现：
4、一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，包括如下步骤：s1、生物素或其衍生物上的羧基与牛血清白蛋白的表面的氨基反应，反应结束后去除游离的生物素，利用中性磷酸盐缓冲液进行透析纯化处理后，得到生物素聚合物，冷冻保存；
5、s2、利用还原剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述S1中，生物素或其衍生物为N-羟基基琥珀酰亚胺酯；
3.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述S1中，生物素或其衍生物与牛血清白蛋白的摩尔浓度比为5:1-30:1；
4.根据权利要求3所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述S1中，加入1M三羟甲基氨基甲烷后反应结束；
5.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述S2中，还原剂为2-巯基乙胺；
6.根据权利要求5所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述S2中，异型双功能交联剂为Sulfo-SMCC、SMCC、MBS中的任意一种；
7.根据权利要求6所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述S2中，还原剂与抗体在室温避光反应30-40min。
8.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合
9.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，还包括在获得的生物素化抗体中加入50％总体积的丙三醇，置于-20℃储存。
...【技术特征摘要】
1.一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述s1中，生物素或其衍生物为n-羟基基琥珀酰亚胺酯；
3.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述s1中，生物素或其衍生物与牛血清白蛋白的摩尔浓度比为5:1-30:1；
4.根据权利要求3所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述s1中，加入1m三羟甲基氨基甲烷后反应结束；
5.根据权利要求1所述的一种抗体定向标记生物素聚合物的方法，其特征在于，所述s2中，还原剂为2-巯基乙胺；
6....
【专利技术属性】
技术研发人员：刘欣，柳乐，王健，周献军，黄敬双，鲜静，张伟，段继龙，许敏，范雨鑫，
申请(专利权)人：四川希格瑞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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