【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其涉及一种肾上腺皮质癌生物标志物的筛选方法。
技术介绍
1、肾上腺皮质癌(acc)是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，发病率约为所有恶性肿瘤的0.1％。肾上腺皮质癌在发现时一般已经形成较大的肿瘤，同时acc患者的预后较差，大多数患者在接受根治性手术后仍出现局部复发和转移；而除了根治性手术，治疗方法很少，传统药物实际疗效有限。由于的acc异质性，目前，对于acc而言除了肿瘤分期外并没有更好的预后指标，基于肿瘤分期的局限性，快速鉴别肾上腺皮质癌的恶性程度、预后分子分型，对治疗方案的选择等具有重要价值。
2、肿瘤突变负荷(tmb)是每百万碱基中被检测出的，体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数，是一种评价基因突变频率高低的指标。tmb反映了肿瘤细胞基因组的变异程度，高tmb(high tumor mutational burden,tmb-h)的肿瘤患者具有获得更多新生抗原的潜力，并且与肿瘤内异质性有关，理论上，高tmb能增强肿瘤免疫原性。
3、目前，高的肿瘤突变负荷(tmb)已被发现与肾上腺皮质癌(acc)的预后不良有关，基于tmb探索acc的生物标志物，患者的危险分层和挖掘新的治疗靶点有着重要意义。但在tmb作为基因标志物的研究中，确保计算tmb的方法学准确性仍然是关键，准确的tmb值才能真实反应科学研究的生物学意义，在生物信息学算法上，准确识别肿瘤细胞的突变是重中之重，如何最大限度地排除假阳性、假阴性变异位点对tmb计算的干扰依然是关键；但tmb的检测受样本质量、检测
4、加权基因共表达网络分析(wgcna)是一种描述不同样品之间基因关联模式的系统生物学方法，可以用来鉴定高度协同变化的基因集,并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定候补生物标记基因。加权基因共表达网络分析(wgcna)可以作为筛选肾上腺皮质癌生物标志物的方法，但是目前该技术仍存在样本过少或共表达模块不稳定，不具有重现性的问题，并且对结果的解读不一。
5、另一方面，染色质dna在行使转录以及复制合成的功能过程中，蛋白质需要脱离dna，使其处于裸露状态，即折叠结构变成松散状态时，这种裸露的dna便于启动转录以调控基因的表达。这种允许启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件和反式作用因子能够与染色质dna物理接触的程度就称为染色质可及性(chromatin accessibility)。染色质打开或者关闭的变化，控制着细胞中的基因表达过程，与人类的各种特征和疾病有关，特别是癌症、染色质相关罕见病。目前，atac-seq是近年来分析全基因组染色质可及性首选的技术方法，所使用的样本量较小，可以检测到dna的结合蛋白以及转录结合位点，一般用于未知转录因子或特定调控因子的筛查，但仍然具有一定的局限性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种更准确的基于肿瘤突变负荷筛选肾上腺皮质癌生物标志物的方法与应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
3、第一方面，本专利技术提供了一种肾上腺皮质癌生物标志物的筛选方法，利用加权基因共表达网络分析和染色质开放性测序技术筛选肾上腺皮质癌生物标志物，包括以下步骤：
4、s1、获取肾上腺皮质癌的rna-seq数据样本，将样本作预处理后再进行加权基因共表达网络分析和热图分析，获得与肿瘤突变负荷相关性最高的基因模块；
5、s2、获取肾上腺皮质癌的atac-seq数据样本，用染色质开放性测序技术分析肾上腺皮质癌中的差异峰基因；
6、s3、对肾上腺皮质癌的rna-seq数据样本的所有基因分别作单因素cox回归和计算受试者工作特征曲线roc，根据样本的单因素cox分析回归分析的风险比hr值和受试者工作特征曲线的线下面积auc筛选得到基因标志物组；
7、s4、将步骤s1的基因模块、步骤s2的差异峰基因以及步骤s3的初步筛选的基因标志物组进行交集，得到交集基因标志物组；以geo数据集中肾上腺皮质癌队列数据作为外部验证集，对交集基因标志物组中的每个基因分别计算受试者工作特征曲线的线下面积auc以及单因素cox回归，验证得到肾上腺皮质癌的生物标志物；
8、所述肾上腺皮质癌生物标志物为lmnb1基因。
9、肾上腺皮质癌(acc)是一种罕见的肿瘤，生存率低，药物有效率低。并且由于acc的异质性目前除了肿瘤分期以外并没有更好的预后指标。但是肿瘤分期的局限性是有限的。肿瘤突变负荷(tmb)是一种研究肿瘤异质性的重要指标，它表示了癌症中基因组的不稳定性和突变。因此，基于肿瘤突变负荷筛选肾上腺皮质癌生物标志物是一种寻找潜在acc治疗靶点的方法。
10、本专利技术采用加权基因共表达分析网络(wgcna)获得肾上腺皮质癌中与肿瘤突变负荷相关的基因模块。wgcna是一种分析多个样本基因表达模式方法，可将表达模式相似的基因进行聚类，并分析模块与特定性状或表型之间的关联关系，因此在疾病以及其他性状与基因关联分析等方面的研究中被广泛应用。wgcna使用权重共表达策略(无尺度分布)，更加符合生物学现象。本申请通过wgcna以及热图分析获得筛选得到的肾上腺皮质癌中与肿瘤突变负荷相关的基因模块，皮尔逊相关性系数r＝0.51，p＝1.7e-26，说明该基因模块与肾上腺皮质癌中肿瘤突变负荷相关。
11、作为本专利技术所述方法优选实施方式，所述步骤s1中，从tcga公共数据库下载肾上腺皮质癌的rna-seq数据样本；所述预处理为根据数据样本肿瘤突变负荷tmb值的高低，对rna-seq数据样本四等均分后进行聚类分析并去除异常样本。
12、作为本专利技术所述方法优选实施方式，步骤s1中，所述加权基因共表达网络分析根据数据样本建立基因模块，并将最接近的基因模块进行合并；所述合并过程中基因模块合并截断值为0.25，最小基因模块体积为30。
13、作为本专利技术所述方法优选实施方式，所述步骤s2中，从tcga公共数据库下载肾上腺皮质癌的atac-seq数据样本；对获取的atac-seq数据样本进行分组并分别进行染色质开放性测序技术分析；所述分组标准为根据atac-seq数据样本的肿瘤突变负荷tmb值的中位值样本分为tmb high组和tmb low组。
14、作为本专利技术所述方法优选实施方式，所述染色质开放性测序技术中，对atac-seq数据样本进通过差异峰分析和差异峰注释获得肾上腺皮质癌中的差异峰基因。
15、作为本专利技术所述方法优选实施方式，通过chipseeker进行差异峰注释，所述差异峰注释的参数为远端基因间区的百分比。
16、本专利技术通过染色质开放性测序技术(atac-seq)探索与tmb相关的差异峰基因，并且使用chipseeker对获得的差异可及峰进行标注，所述远端基因间区(distalintergenic)为非启动子元件的远端元件；结果本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肾上腺皮质癌生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，从TCGA公共数据库下载肾上腺皮质癌的RNA-seq数据样本；所述预处理为根据数据样本肿瘤突变负荷TMB值的高低，对RNA-seq数据样本四等均分后进行聚类分析并去除异常样本。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述加权基因共表达网络分析根据数据样本建立基因模块，并将最接近的基因模块进行合并；所述合并过程中基因模块合并截断值为0.25，最小基因模块体积为30。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，从TCGA公共数据库下载肾上腺皮质癌的ATAC-seq数据样本；对获取的ATAC-seq数据样本进行分组并分别进行染色质开放性测序技术分析；所述分组标准为根据ATAC-seq数据样本的肿瘤突变负荷TMB值的中位值样本分为TMB High组和TMB Low组。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色质开放性测序技术中，对ATAC-seq数据样本通过差异峰分析和差异峰注释获
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过ChIPseeker进行差异峰注释，所述差异峰注释的参数为远端基因间区的百分比。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，从TCGA公共数据库下载肾上腺皮质癌的RNA-seq数据样本；对样本的所有基因以中位数OS时间以及中位数PFI时间来计算受试者工作特征曲线的线下面积AUC。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，以样本的单因素COX分析回归风险比HR和受试者工作特征曲线的线下面积AUC作为标准初步筛选基因标志物组；所述筛选标准为AUC≥0.7且HR＞1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GEO数据集包括两个儿童肾上腺皮质癌队列：GSE 76019、GSE 76021和两个成人肾上腺皮质癌队列GSE 19750、GSE 10927。
10.LMNB1检测试剂在制备肾上腺皮质癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述LMNB1检测试剂通过检测LMNB1基因表达量或LMNB1基因表达产物进行肾上腺皮质癌的诊断或预后评估。
...【技术特征摘要】
1.一种肾上腺皮质癌生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1中，从tcga公共数据库下载肾上腺皮质癌的rna-seq数据样本；所述预处理为根据数据样本肿瘤突变负荷tmb值的高低，对rna-seq数据样本四等均分后进行聚类分析并去除异常样本。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述加权基因共表达网络分析根据数据样本建立基因模块，并将最接近的基因模块进行合并；所述合并过程中基因模块合并截断值为0.25，最小基因模块体积为30。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中，从tcga公共数据库下载肾上腺皮质癌的atac-seq数据样本；对获取的atac-seq数据样本进行分组并分别进行染色质开放性测序技术分析；所述分组标准为根据atac-seq数据样本的肿瘤突变负荷tmb值的中位值样本分为tmb high组和tmb low组。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色质开放性测序技术中，对atac-seq数据样本通过差异峰分析和差异峰注释获得肾上...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢剑铭，蔡周达，杨静静，陈奕豪，陈佳鸿，郑煜，邓军洪，梁安韵，
申请(专利权)人：广州市第一人民医院广州消化疾病中心，广州医科大学附属市一人民医院，华南理工大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：
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