【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于her2阳性质控品，涉及一种通过类器官异种移植肿瘤制备her2阳性质控品的方法。
技术介绍
1、人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，her2），是一种位于乳腺和乳腺癌细胞表面的受体，能够控制癌细胞的生长、浸润和癌细胞的转移，大约20％的乳腺癌病例中存在her2 基因和/或蛋白水平增加，它是乳腺癌的独立预后因子，在乳腺癌的靶向治疗和预后判断中的作用已经得到了全世界临床医生的认可。乳腺癌患者her2 水平检测已经成为常规的临床检测指标，目前的检测方法主要有两种：免疫组化（ihc）法测定her2 过表达（hercep test/dako）；荧光原位杂交（fish）法检测her2基因扩增（path vision/vysis）。
2、为保证临床上各检测方法的可靠性，her2阳性质控品成为监测检验过程和检验结果的重要手段。传统意义上用于her2状态检测的质控品主要来源于乳腺癌患者手术切除的肿瘤组织或者活检穿刺标本，这种质控品存在着诸多缺点：它们在来源上比较难获取，涉及伦理学问题，不可批量并持续生产；由于不同患者之间存在异质性，很难保证所有质控样本完全均一；难以满足实际应用需求。
3、硕士学位论文《肿瘤个体化医学检测室间质量评价质控品的研制及其应用》（李禹龙，北京协和医学院，2017），选择具有不同her2基因状态的乳腺癌细胞系，采用细胞系异种移植成瘤的方法制备含有不同细胞系的甲醛固定石蜡包埋（formalin-fixed paraf
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种通过类器官异种移植肿瘤制备her2阳性质控品的方法。类器官是指由一簇具有自我更新、自我组织能力的细胞在体外构成的3d微型器官，在一定程度上类似于人体真实的组织器官。与2d细胞培养相比，类器官拥有与对应器官相似的细胞、空间组织，能在体外长期培养并模拟真实器官的功能，将不同细胞进行类器官培养后，再将类器官进行异种移植，可大大提高成瘤率，并且成瘤时间短，获得异种移植肿瘤制备的阳性质控品具备阳性和阴性细胞和肿瘤组织结构，与临床真实样本一致性更高。本专利技术的目的通过以下具体技术方案实现。
2、通过类器官异种移植肿瘤制备her2阳性质控品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、s1 细胞准备：取bt-474和mcf-7细胞分别扩大培养；
4、s2 混合细胞系的类器官培养：待bt-474和mcf-7活细胞浓度达到一定值以后，将bt-474和mcf-7细胞混合后进行类器官培养；
5、s3 类器官异种移植：收获类器官并接种到裸鼠中，观察裸鼠成瘤情况，待肿瘤长至一定体积以后，处死裸鼠，剥离皮下肿瘤；
6、s4 制作石蜡包埋质控品：修剪瘤体组织，处理后将瘤体组织制成石蜡包埋质控品。
7、进一步的，还包括步骤s5：将制成的石蜡包埋质控品使用her2抗体进行免疫组化分析。
8、进一步的，步骤s1的具体操作为：
9、s1-1 从液氮罐中取出bt-474和mcf-7细胞，迅速投入到水浴中解冻，待解冻完全后，吸取细胞悬液分别加入至培养基中，离心；
10、s1-2 离心完毕后，弃上清，吸取新鲜培养基重悬细胞，加入到培养瓶中，补加培养基，置于培养箱中培养；
11、s1-3 每隔一段时间在倒置显微镜下观察细胞的贴壁状态，等培养瓶底细胞汇合度达到85%以上，进行传代与扩大培养操作：弃去培养液，用pbs润洗后，加入胰蛋白酶，置于培养箱中至瓶底细胞收缩脱落，使用新鲜完全培养基重悬，按照一定比例分配到新的培养瓶中，扩大培养。
12、进一步的，步骤s2的具体操作为：
13、s2-1 分别取对数生长期的mcf-7和bt-474细胞，重悬于pbs中，取样使用台盼蓝染色后计数，调整pbs细胞悬液的活细胞浓度至8×105cells /ml以上；
14、s2-2 分别取mcf-7和bt-474细胞悬液，加入预冷的基质胶，使用移液器充分吹打混匀；
15、s2-3 将步骤s2-2的混合物接种至预热过的孔板中，室温下静置，凝固；
16、s2-4 每个孔中加入dmem/f-12，在hepes条件培养基培养，培养基中包含人重组r-脊椎蛋白3、神经调节蛋白1、fgf7重组蛋白、fgf10重组蛋白、重组人 noggin因子、tgf-βi型受体抑制剂、反式-4-[(r)-1-氨基乙基]-n-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐、 4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑、1x b 27、烟酰胺、青链霉素，放入培养箱中培养；
17、s2-5 定期更换条件培养基：在倒置显微镜下观察类器官的生长情况，在孔板中更换预冷的dmem/f-12和hepes空白培养基，用无菌枪头切碎类器官培养囊泡，将囊泡转移至tryple express重组酶中室温孵育，使用细胞筛过滤后，离心去除上清，以一定比例加基质胶重新接种至孔板中。
18、进一步的，步骤s3将每个孔收获的类器官重悬于dmem/f-12、hepes条件培养基和基质胶混合物中，然后接种到裸鼠中，待肿瘤长至200mm3以上时处死裸鼠。
19、进一步的，步骤s4的具体操作为：
20、s4-1 用手术剪修剪瘤体组织，加入到福尔马林溶液中固定24-48小时；
21、s4-2 将固定后的瘤体组织依次进行乙醇梯度脱水、透明处理、浸蜡和包埋；
22、s4-3 使用包埋机将进行二次包埋；
23、s4-4 使用切片机进行切片，厚度5-8μm/张，置于展片池进行展片，用载玻片捞片后晾干水分，50-70℃烤片1-2h。
24、本专利技术具有以下有益技术效果：能够批量生产重复性好的her2阳性质控品，不存在使用人标本的伦理学问题，样本切本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.通过类器官异种移植肿瘤制备HER2阳性质控品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤S5：将制成的石蜡包埋质控品使用HER2抗体进行免疫组化分析。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1的具体操作为：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2的具体操作为：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3将每个孔收获的类器官重悬于DMEM/F-12、HEPES条件培养基和基质胶混合物中，然后接种到裸鼠中，待肿瘤长至200mm3以上时处死裸鼠。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4的具体操作为：
【技术特征摘要】
1.通过类器官异种移植肿瘤制备her2阳性质控品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤s5：将制成的石蜡包埋质控品使用her2抗体进行免疫组化分析。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1的具体操作为：
4.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：许波，侯雨晨，王军，
申请(专利权)人：苏州水木济衡生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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