【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学检测，具体涉及一种3-羟基苯基丙酸衍生物、3-羟基苯基丙酸免疫检测试剂及其制备方法。
技术介绍
1、孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders，asd)是一种起病于婴幼儿时期的神经发育障碍性疾病，患病率呈逐年上升趋势，该病以社会沟通与交往障碍，局限的、重复的刻板行为，狭窄的兴趣或活动为核心症状。3-羟基苯基丙酸(3-hydroxyphenylpropionicacid，3hpp)是肠道中梭菌类代谢副产物与人体代谢产物结合产生的苯丙氨酸异常代谢产物—m-酪氨酸的代谢产物，分子式为c9h10o3，分子量为166.17。能产生3hpp的梭菌包括生孢梭菌、肉毒杆菌、耐热芽孢杆菌、芒氏梭菌、戈氏梭菌、双酶杆菌、艰难梭菌和索氏芽孢杆菌。临床上，尿液3-羟基苯基丙酸含量的检测具有重要的临床意义。3hpp能够消耗儿茶酚胺，可引起如刻板行为，极度活跃高度-反应性的孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders，asds)样行为。高浓度的3hpp通过抑制多巴胺-β羟化酶，导致神经递质平衡紊乱，发生行为障碍和精神性问题，包括：抽搐、抑郁、孤独症、精神分裂症等。asds患者尿液中3hpp含量明显升高，检测尿液中3hpp的含量，有助于早期发现asds患者，及早进行行为干预和教育，改善asds患儿的不良预后情况。
2、检测3-羟基苯基丙酸的实验室方法有比色法、放射免疫分析法、高效液相色谱法、液相串联质谱法、酶联免疫吸附测定法等。比色法检测的是3-羟基苯基丙酸等类似物质的总量而非单
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是：提供一种3-羟基苯基丙酸衍生物、3-羟基苯基丙酸免疫检测试剂及其制备方法，实现3-羟基苯基丙酸的高通量、快速化检测。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一、提供一种3-羟基苯基丙酸衍生物，其结构式如下述式(ⅰ)所示：
4、
5、二、提供一种上述的3-羟基苯基丙酸衍生物的制备方法，所述制备方法的合成路线如下：
6、
7、具体的制备步骤如下：
8、a.化合物2的合成
9、
10、将化合物1(10g，0.09mol)与无水丙二酸(25g，0.24mmol)加入无水吡啶(200ml)中，同时加入几滴哌啶，制成反应混合物溶液，将所述反应混合物溶液在80℃下加热1小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液冷却，然后用hcl溶液(～20ml)进行酸化使产物沉淀；制备得到的固体产物，经过滤，然后从乙醇中重结晶，得到化合物2。
11、b.化合物3的合成
12、
13、将化合物2(8.2g，0.05mol)溶解于100ml meoh中，然后逐滴加入10％pd/c(0.8g)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在通入h2并处于室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物3。
14、c.化合物4的合成
15、
16、将化合物3(3.3g，0.02mol)溶解于100ml dcm中，然后逐滴加入hatu(7.6g，0.02mol)、tea(2.0g，0.02mol)以及(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯(3.2g，0.02mol)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物用硅胶柱层析法进行纯化，得到化合物4。
17、d.3-羟基苯基丙酸衍生物的合成
18、
19、将化合物4(1.6g，0.005mol)溶解于50ml meoh中，然后逐滴加入hcl/meoh(20ml，2m)，制成反应混合物溶液，然后将所述反应混合物溶液在室温(20～25℃)条件下搅拌12小时；反应结束后，将所述反应混合物溶液进行过滤，然后在减压条件下进行蒸馏，然后进行真空干燥；所得剩余物通过制备级高效液相色谱(pre-hplc)纯化，得到3-羟基苯基丙酸衍生物(3-(3-hydroxyphenyl)propanoic acid derivative)。
20、三、提供一种3-羟基苯基丙酸免疫原，由上述的3-羟基苯基丙酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(ⅱ)所示：
21、
22、四、提供一种上述的3-羟基苯基丙酸免疫原的制备方法，包括以下步骤：
23、a.称取5.0～25.0mg上述式(ⅰ)所示的3-羟基苯基丙酸衍生物，溶解于5.0～25.0ml磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/l、ph＝8.5)中，得到3-羟基苯基丙酸衍生物溶液；
24、b.称取10.0～50.0mg甲基化的牛血清白蛋白、1.0～10.0mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、50.0～100.0mg sulfo-nhs,溶解于1.0～5.0ml磷酸钾缓冲液(浓度为10.0mmol/l、ph＝4.5～5.0)中，然后在室温条件下搅拌反应5～25分钟，得到甲基化的牛血清白蛋白活性溶液；
25、c.将步骤b中得到的甲基化的牛血清白蛋白活性溶液直接倒入步骤a中得到的3-羟基苯基丙酸衍生物溶液中混匀，得到偶联反应混合溶液，然后将所述偶联反应混合溶液在室温条件下搅拌反应10～60分钟，搅拌结束后在2～8℃条件下静置12小时，得到3-羟基苯基丙酸免疫原溶液。
26、d.将步骤c中得到的3-羟基苯基丙酸免疫原溶液通过g-25葡聚糖凝胶层析柱纯化，纯化后得到3-羟基苯基丙酸免疫原，置于-20℃下储存。
27、五、提供一种抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体，所述抗体是由上述的3-羟基苯基丙酸免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
28、六、提供一种上述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
29、a.将上述式(ⅱ)所示的3-羟基苯基丙酸免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0～5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0～5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种3-羟基苯基丙酸衍生物，其特征在于：其结构式如下述式(Ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物的制备方法，其特征在于：所述制备方法的合成路线如下：
3.一种3-羟基苯基丙酸免疫原，其特征在于：由权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：
4.一种如权利要求3所述的3-羟基苯基丙酸免疫原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.一种抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体，其特征在于：所述抗体是由权利要求3所述的3-羟基苯基丙酸免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
6.一种如权利要求5所述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.一种3-羟基苯基丙酸酶标偶联物，其特征在于：由权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式(Ⅲ)所示：
8.一种如权利要求7所述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物的制备方法，其
9.一种3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂，其特征在于：包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含权利要求5所述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体和均相酶底物溶液，所述均相酶底物溶液由葡萄糖-6-磷酸和Tris缓冲液配制而成；所述R2试剂包含权利要求7所述的3-羟基苯基丙酸酶标偶联物和辅酶溶液，所述辅酶溶液由氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Tris缓冲液配制而成。
10.一种如权利要求9所述的3-羟基苯基丙酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种3-羟基苯基丙酸衍生物，其特征在于：其结构式如下述式(ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物的制备方法，其特征在于：所述制备方法的合成路线如下：
3.一种3-羟基苯基丙酸免疫原，其特征在于：由权利要求1所述的3-羟基苯基丙酸衍生物与甲基化的牛血清白蛋白连接而成，其结构式如下述式(ⅱ)所示：
4.一种如权利要求3所述的3-羟基苯基丙酸免疫原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.一种抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体，其特征在于：所述抗体是由权利要求3所述的3-羟基苯基丙酸免疫原免疫实验动物后产生的多克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。
6.一种如权利要求5所述的抗3-羟基苯基丙酸特异性抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：王益超，吕翠云，赵玉冰，张小可，
申请(专利权)人：合肥爱索特克医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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