【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肟菌酯的检测，具体涉及一种用于检测肟菌酯的胶体金试纸条，其特别适用于果蔬中肟菌酯残留的检测。
技术介绍
1、肟菌酯(trifloxystrobin)属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过阻止细胞腺苷三磷酸酶的合成，从而抑制线粒体呼吸而发挥抑菌作用，对多数真菌都有强烈的抑制作用。由于其具有高效、广谱、持效期长等特性，且对作物和环境安全，常用于防治稻瘟病、稻曲病、纹枯病等，但其不合理的使用带来的残留会对土壤和水生生态系统产生破坏。尽管肟菌酯毒性较低，但由于食品安全学科的发展及人们对食品安全性的关注度的提升，许多国家对于其在食品、农作物上的残留已给出了相关的最高残留限量(mrl)，我国国家标准gb 2763中规定肟菌酯在蔬菜水果中的mrl为0.05～15mg/kg。
2、目前已报道的检测肟菌酯的方法主要是气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于果蔬中肟菌酯残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有的检测肟菌酯的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、
2、为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了一种检测肟菌酯的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上具有包被有肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述结合物释放垫上喷涂有肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物。
3、所述肟菌酯单克隆抗体是以肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
4、所述肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物由肟菌酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白；
5、所述肟菌酯半抗原的合成方法为：取2-[2-[(4-乙酰苯氧基)甲基]苯基]-2-甲氧基亚氨基乙酸甲酯3.41g，加乙醇200ml溶解；取2-(氨基氧基)乙酸1.27g，加水20ml溶解，加吡啶50ml，充分搅拌，混匀，滴加到上述乙醇溶液中，室温反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙醇及吡啶，加水200ml、乙酸乙酯100ml，萃取，分去水相，有机相蒸干，上硅胶柱，用体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱分离，得到肟菌酯半抗原，其分子结构式为：
6、
7、所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
8、所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
9、本专利技术还提供了一种制备上述试纸条的方法，其包括以下步骤：
10、1)制备喷涂有肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
11、2)制备具有包被有肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
12、3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
13、具体地说，步骤包括：
14、1)以2-[2-[(4-乙酰苯氧基)甲基]苯基]-2-甲氧基亚氨基乙酸甲酯为起始原料，经与2-(氨基氧基)乙酸在弱碱吡啶的催化下进行缩合反应，制备肟菌酯半抗原；
15、2)将肟菌酯半抗原与载体蛋白偶联，制备肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物；
16、3)用肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌肟菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
17、4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
18、5)分别将肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；
19、6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
20、7)将制备的肟菌酯单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物；
21、8)将肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，置于干燥环境中保存备用；
22、9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、ph为7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；
23、10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，4～30℃条件下保存12个月。结合物释放垫的1/3被样品吸收垫覆盖可以延长检测结果观察时间，使样品吸收垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。
24、本专利技术还提供了一种应用上述试纸条检测样品中肟菌酯残留的方法，它包括以下步骤：
25、(1)样品前处理；
26、(2)用试纸条进行检测；
27、(3)分析检测结果。
28、本专利技术的肟菌酯快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的肟菌酯在流动过程中与结合物释放垫上的肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成肟菌酯-抗体-胶体金标记物。样本中的肟菌酯与反应膜检测线上的肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有肟菌酯残留。
29、检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当肟菌酯在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果肟菌酯在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与肟菌酯全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图2所示。
30、阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。
31、阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。
32、无效：当质控本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测肟菌酯的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物；所述肟菌酯单克隆抗体是以肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物由肟菌酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，其特征在于，所述肟菌酯半抗原的合成方法为：
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上。
3.如权利要求1-2任一项所述的试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种应用权利要求1-3任一项所述试纸条检测样品中肟菌酯的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种检测肟菌酯的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有肟菌酯单克隆抗体-胶体金标记物；所述肟菌酯单克隆抗体是以肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得；所述肟菌酯半抗原-载体蛋白偶联物由肟菌酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，其特征在于，所述肟菌酯...
【专利技术属性】
技术研发人员：王兆芹，杜玲，李静，张姗姗，刘国强，刘强辉，张广胜，王蕾，
申请(专利权)人：北京勤邦科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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