【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种携带安全开关的滋养细胞及其在nk细胞培养中的应用，属于基因工程和nk细胞培养。
技术介绍
1、自然杀伤(nk)细胞是机体内重要的免疫细胞，形态上属于大颗粒淋巴细胞，是除t细胞、b细胞之外的第三大类淋巴细胞。与t细胞、b细胞等其他适应性免疫细胞不同，nk细胞无需抗原呈递即可直接识别和杀死肿瘤细胞。此外，nk细胞缺乏t细胞受体(tcr)，不会引起细胞因子释放综合征(crs)、移植物抗宿主病(gvhd)与神经毒性，因此近年来基于nk细胞的新型癌症治疗方法开发势头强劲。
2、目前用于肿瘤免疫治疗的nk细胞主要通过体外诱导扩增技术获得，其来源丰富，主要有外周血、脐血、造血干细胞、诱导性多能干细胞以及nk-92细胞系。然而，nk细胞的生产仍然存在许多问题，其中如何在体外获得大量的高纯度高杀伤性的优质nk细胞是核心问题之一。原代nk细胞体外培养形式多样，主要有因子法与滋养细胞法，因子法扩增nk细胞效率有限，成本较高且纯度较低；通过滋养细胞法刺激nk细胞增殖，虽可得到高纯度高质量的nk细胞，但扩增效率仍有不足，且具有一定的安全风险：一般选用的k562肿瘤细胞作为滋养细胞虽然在使用前会对其进行辐照，并且输注前会提前移除滋养细胞并确保无任何残留，但仍会引起人们对输注风险的担忧。
技术实现思路
1、针对上述现有的问题，本专利技术提供了一种携带安全开关的滋养细胞，以及其在nk细胞培养中的应用。本专利技术的携带安全开关的滋养细胞，可稳定表达cd48、cd137l、cd64、膜结
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种携带安全开关的滋养细胞，其基因组中包含有cd48基因、cd137l基因、cd64基因、mbil21基因、icaspase9基因和tcd19基因。
4、所述携带安全开关的滋养细胞的构建方法，如下：将cd48基因、cd137l基因、cd64基因、mbil21基因、icaspase9基因和tcd19基因通过慢病毒表达系统，包装慢病毒，再通过慢病毒感染的方法使得cd48、cd137l、cd64、mbil21、icaspase9、tcd19稳定表达在k562细胞上，得到稳定表达的携带安全开关的滋养细胞。
5、所述携带安全开关的滋养细胞在nk细胞培养中的应用。
6、进一步地，具体应用时，将携带安全开关的滋养细胞扩大培养，然后用100gy的γ射线辐照，即可作为滋养细胞用于nk细胞的体外培养。
7、一种nk细胞的培养方法，如下：将携带安全开关的滋养细胞与nk细胞混合，重悬于培养基中，接种于细胞培养板(比如六孔板)，在37℃、5％co2条件下培养14～21天，间隔一天补充新鲜培养基；所述培养基由8％～12％的胎牛血清(fbs)(体积百分数)、180～220u/ml的il2和余量的基础培养基组成，优选的，由10％的胎牛血清、200u/ml的il2和余量的基础培养基组成。
8、进一步地，所述携带安全开关的滋养细胞，事先用100gy的γ射线辐照。
9、进一步地，所述携带安全开关的滋养细胞与nk细胞的数量比例为1.5～2.5:1，优选2:1。
10、进一步地，所述培养基中nk细胞的密度为2.5×105/ml～1.0×106/ml，优选5.0×105/ml。
11、进一步地，所述基础培养基选自nk-macs培养基、kbm 581培养基、加强型nk细胞无血清培养基中的任意一种或两种以上，优选加强型nk细胞无血清培养基。
12、本专利技术通过慢病毒感染的方法，使cd48、cd137l、cd64、mbil21、icaspase9和tcd19可以在k562细胞中稳定表达，获得携带安全开关的k562-cd48-cd137l-cd64-mbil21-icaspase9-tcd19滋养细胞。cd48/2b4信号通路在nk细胞的活化、介导细胞毒性、产生细胞因子方面发挥重要作用。4-1bb/cd137l(4-1bbl)信号通路在nk细胞的激活中起重要作用，并且增强nk细胞增殖和存活能力。cd64能增强nk细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc)效应。il21是nk细胞功能的重要调节因子，能够增强nk细胞细胞毒性活性、增殖能力和adcc作用。cd19可以激活并提升nk细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，也可以作为细胞表面标志物对携带icaspase9的滋养细胞进行分选。icaspase9在凋亡诱导物(如ap20187)的存在下，可快速诱导细胞凋亡，实现了对滋养细胞增殖的快速调控，减少输注风险。本专利技术的携带安全开关的滋养细胞在应用于nk细胞培养时，先利用γ射线辐照使其失去增殖功能(但是保留其刺激nk增殖的活性)，然后与nk细胞进行共培养，同时采用特定的培养基，补充细胞因子il2，在体外扩大培养得到大量高质量nk细胞；在扩培过程中采用ao/pi计数方法检测nk细胞增殖，流式细胞术检测nk细胞纯度，利用荧光素酶检测nk细胞的杀伤性能。本专利技术对nk细胞的培养具有重要意义。
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1.一种携带安全开关的滋养细胞，其特征在于：其基因组中包含有CD48基因、CD137L基因、CD64基因、mbIL21基因、iCaspase9基因和tCD19基因。
2.权利要求1所述的携带安全开关的滋养细胞的构建方法，其特征在于：将CD48基因、CD137L基因、CD64基因、mbIL21基因、iCaspase9基因和tCD19基因通过慢病毒表达系统，包装慢病毒，再通过慢病毒感染的方法使得CD48、CD137L、CD64、mbIL21、iCaspase9、tCD19稳定表达在K562细胞上，得到稳定表达的携带安全开关的滋养细胞。
3.权利要求1所述的携带安全开关的滋养细胞在NK细胞培养中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用时，将携带安全开关的滋养细胞扩大培养，然后用γ射线辐照。
5.一种NK细胞的培养方法，其特征在于：将权利要求1所述的携带安全开关的滋养细胞与NK细胞混合，重悬于培养基中，接种于细胞培养板，在37℃、5％CO2条件下培养14～21天，间隔一天补充新鲜培养基；所述培养基由8％～12％的胎牛血清
6.根据权利要求5所述的NK细胞的培养方法，其特征在于：所述培养基由10％的胎牛血清、200U/mL的IL2和余量的基础培养基组成。
7.根据权利要求5所述的NK细胞的培养方法，其特征在于：所述携带安全开关的滋养细胞，事先用100Gy的γ射线辐照。
8.根据权利要求5所述的NK细胞的培养方法，其特征在于：所述携带安全开关的滋养细胞与NK细胞的数量比例为1.5～2.5:1。
9.根据权利要求5所述的NK细胞的培养方法，其特征在于：所述培养基中NK细胞的密度为2.5×105/mL～1.0×106/mL。
10.根据权利要求5所述的NK细胞的培养方法，其特征在于：所述基础培养基选自NK-MACS培养基、KBM 581培养基、加强型NK细胞无血清培养基中的任意一种或两种以上。
...【技术特征摘要】
1.一种携带安全开关的滋养细胞，其特征在于：其基因组中包含有cd48基因、cd137l基因、cd64基因、mbil21基因、icaspase9基因和tcd19基因。
2.权利要求1所述的携带安全开关的滋养细胞的构建方法，其特征在于：将cd48基因、cd137l基因、cd64基因、mbil21基因、icaspase9基因和tcd19基因通过慢病毒表达系统，包装慢病毒，再通过慢病毒感染的方法使得cd48、cd137l、cd64、mbil21、icaspase9、tcd19稳定表达在k562细胞上，得到稳定表达的携带安全开关的滋养细胞。
3.权利要求1所述的携带安全开关的滋养细胞在nk细胞培养中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用时，将携带安全开关的滋养细胞扩大培养，然后用γ射线辐照。
5.一种nk细胞的培养方法，其特征在于：将权利要求1所述的携带安全开关的滋养细胞与nk细胞混合，重悬于培养基中，接种于细胞培养板，在...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭君，刘璇，张癸荣，郭芳蕾，李明月，张建，韩秋菊，
申请(专利权)人：山东银丰生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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