【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物领域，特别是涉及一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。近年来，我国前列腺癌发病率呈现逐年上升的趋势。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95%发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。
2、前列腺癌的临床诊断方式目前主要有直肠指检、血清前列腺特异性抗原（psa）检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检主要通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。直肠指检的局限性主要在患者前列腺肿块不大时或者医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。正常情况下血液中的psa不高（不高于4ng／ml），当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时，psa升高成为目前筛查前列腺癌最常用的标志物，但其也存在一定局限性，psa检测需要取血检测，对患者有一定的损伤，前列腺炎症和前列腺肥大时psa也会增高。前列腺超声波检测操作简单直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形体、有无钙化及钙化的形态、大小、数目、分布以及周围的晕环、皮肤
3、目前临床用于前列腺癌筛查的最常用标志物是血清psa检测,psa通过前列腺导管进入血液和尿液中，血清中psa含量高于10ng/ml认为是前列腺癌阳性，在浓度4-10ng/ml灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定。所以psa并不能较好的作为诊断前列腺癌的标志物。经psa为基础的筛查发现的患者中有约1/3为进展缓慢、侵袭性低、无临床症状的隐匿性前列腺癌，导致部分病例过度诊治，增加了不必要的痛苦和损伤。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法、试剂盒及其应用，使用本专利技术试剂盒筛查前列腺癌，尿液取材方便，安全无创伤，且具有较高的特异性和灵敏度及易于大量筛查的特点。
2、本专利技术提供了一种基于尿液样本的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，包括：
3、采集受检的尿液样本；
4、提取所述受检的尿液样本的基因组；
5、对所述基因组进行亚硫酸盐转化及纯化，得到基因组溶液。
6、在一实施例中，所述提取所述受检的尿液样本的基因组，采用天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒（dp304），包括：
7、取2ml尿液样本到离心管中，以10000rpm离心1min后，倒出上清；
8、加入200μl缓冲液ga震荡至悬浮，加入200μl缓冲液gb和20μlproteinase k的预混溶液，颠倒混合均匀，在70℃的环境中放置10min中，并间断地颠倒混合均匀，直至溶液变清亮，离心以除去管盖内壁的水珠；
9、加入200μl无水乙醇，震荡混合均匀15sec，离心以除去管盖内壁的水珠，得到带有絮状沉淀的混合溶液；
10、将所述带有絮状沉淀的混合溶液加入吸附柱cb3中，吸附柱cb3位于收集管中，以12000rpm离心30sec，将吸附柱cb3从收集管中取出，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
11、向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，以12000rpm离心30sec，将吸附柱cb3从收集管中取出，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
12、向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12000rpm离心30sec，将吸附柱cb3从收集管中取出，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
13、再次向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12000rpm离心30sec，将吸附柱cb3从收集管中取出，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
14、以12000rpm对收集管离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温2min，以晾干吸附柱cb3中的漂洗液；
15、将晾干后的吸附柱cb3转入离心管中，向吸附膜上滴加50ml洗脱缓冲液te，室温放置2min，再以12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，得到基因组产物。
16、在一实施例中，所述对所述基因组进行亚硫酸盐转化及纯化，采用天根生化科技（北京）有限公司的dna重亚硫酸盐转化试剂盒（dp215），包括：
17、配置亚硫酸氢盐混合物，在每管干粉中加入850μl缓冲液bm，震荡混合5-6min，以使干粉全部溶解；
18、取20μl所述基因组产物、10μl缓冲液dp、90μl亚硫酸氢盐混合物在离心管中混合，配置为重亚硫酸盐反应体系；
19、将所述重亚硫酸盐反应体系放入pcr仪中进行转化，转化进程为： 在95℃下反应10min；
20、在64℃下反应30-60min；
21、获得重亚硫酸盐转化物，并在4℃下保存；
22、将吸附柱cb1置于干净的收集管中，向吸附柱cb1加入500μl平衡液bl，以12000rpm离心1min，将吸附柱cb1从收集管中取出，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱cb1重新放入收集管；
23、取所述重亚硫酸盐转化物转移到干净的离心管中，并加入600μl的结合液pb，混合均匀，得到结合溶液；
24、将所述结合溶液加入所述吸附柱cb1中，在室温下放置2min，以12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液；
25、向所述吸附柱cb1中加入600μl漂洗液pw，以12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液；
26、向所述吸附柱cb1中加入600 μl溶液db，在15-25℃放置15 min，以12,000 rpm 离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液；
27、两次漂洗，首次漂洗，先向吸附柱cb1中加入600 μl漂洗液pw，以12,000 rpm 离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，以首次漂洗的方式再次漂洗，以将漂洗液pw清除干净；
28、将所述吸附柱cb1置于室温放置5-10分钟，晾干；
29、取出所述吸附柱cb1，放入一个干净的离心管中，向所述吸附柱cb1的吸附膜悬空滴加20 μl洗脱缓冲液eb，室温放置2 min，以12000 r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于，所述提取所述受检的尿液样本的基因组，包括：
3.根据权利要求2所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述对所述基因组进行亚硫酸盐转化及纯化，包括：
4.一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒，其特征在于，包括采用权利要求3所述试剂盒制备方法得到的试剂盒。
5.一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒的应用，其特征在于，包括：
6.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述采用基因组溶液进行GSTP1基因甲基化检测，并根据检测结果赋予第一评分包括：
7.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述采用基因组溶液进行RASSF1A基因甲基化检测，并根据检测结果赋予第二评分包括：
8.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述采用受检的尿液样本进行PSA和PSA3检测，并根据检测结果赋
9.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述采用受检的尿液样本进行AMACR检测，并根据检测结果赋予第四评分包括：
10.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述采用受检的尿液样本进行MMP-9检测，并根据检测结果赋予第四评分包括：
...【技术特征摘要】
1.一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于，所述提取所述受检的尿液样本的基因组，包括：
3.根据权利要求2所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述对所述基因组进行亚硫酸盐转化及纯化，包括：
4.一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒，其特征在于，包括采用权利要求3所述试剂盒制备方法得到的试剂盒。
5.一种前列腺癌无创早期筛查试剂盒的应用，其特征在于，包括：
6.根据权利要求1所述的前列腺癌无创早期筛查试剂盒制备方法，其特征在于：所述采用基因组溶液进行gstp1基因甲基化检测，并根据检测结果赋予第一评...
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