【技术实现步骤摘要】
本公开涉及癌症生物研究，尤其涉及一种基于crispr-cas9技术特异性靶向敲除igf2bp1的sgrna载体设计及其在肺腺癌中的应用。
技术介绍
1、crispr-cas9系统是原核生物的一种天然免疫防御系统，经人工改造成为一种靶向特定基因组的基因编辑技术。该技术通过设计特异性sgrna序列从而在基因特定位点进行切割引起dna双链断裂，在细胞中通过非同源末端连接的方式对断裂的dna进行修复，导致发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，从而实现基因的完全敲除。该技术已被广泛应用于各种领域，包括治疗遗传性疾病、农业、再生医学以及基础科学研究。
2、肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，约占肺癌病例的85％，然而肺腺癌作为非小细胞肺癌的主要亚型之一，约占据非小细胞肺癌的55％。目前，肺腺癌的治疗仍然面临许多挑战。我们前期研究表明igf2bp1是肺腺癌的独立预后因子，在肺腺癌中高表达并导致肺腺癌患者更短的生存时间，其在肺腺癌的发生发展中也具有非常重要的作用。抑制igf2bp1的表达可以抑制肺腺癌细胞的进展，可能成为治疗肺腺癌的潜在靶点。
3、有关肺腺癌的研究表明hnf4α(肝细胞核因子4α)可以通过转录激活lncrna bc200的表达来促进浸润性肺粘液腺癌的生长、侵袭和迁移。hnf4α在肺腺癌中差异表达且高表达能显著抑制肺腺癌患者的总体生存率。但hnf4α在肺腺癌中具体的作用机制尚不清楚。
4、目前，针对igf2bp1的靶向抑制，大多采用shrna或者si
技术实现思路
1、本申请一方面，提出一种双sgrna靶向敲除敲除igf2bp1的sgrna，包含两对特异性靶向igf2bp1的sgrna序列，方向均为5’-3’：
2、第一对sgrna序列，包含：
3、sequenceno.1所示的第一正义链：igf2bp2-sgrna-1；
4、sequenceno.2所示的第一反义链：igf2bp2-sgrna-2；
5、第二对sgrna序列，包含：
6、sequenceno.3所示的第二正义链：igf2bp2-sgrna-3；
7、sequenceno.4所示的第二反义链：igf2bp2-sgrna-4。
8、作为本申请的一可选实施方案，可选地，合成所述第一正义链：igf2bp2-sgrna-1所需的两条oligo单链为：
9、sequenceno.5和sequenceno.6所示的oligo单链；
10、合成所述第一反义链：igf2bp2-sgrna-2所需的两条oligo单链为：
11、sequenceno.7和sequenceno.8所示的oligo单链。
12、作为本申请的一可选实施方案，可选地，合成所述第二正义链：igf2bp2-sgrna-3所需的两条oligo单链为：
13、sequenceno.9和sequenceno.10所示的oligo单链；
14、合成所述第二反义链：igf2bp2-sgrna-4所需的两条oligo单链为：
15、sequenceno.11和sequenceno.12所示的oligo单链。
16、本申请另一方面，提出一种利用所述双sgrna靶向敲除igf2bp1的sgrna构建得到的靶向igf2bp1敲除的sgrna慢病毒敲除载体。
17、本申请另一方面，提出一种igf2bp1慢病毒敲除载体，采用上述sgrna慢病毒敲除载体，转化得到。
18、本申请另一方面，还提出一种所述双sgrna靶向敲除igf2bp1的sgrna，在敲除igf2bp1中基因中的应用。
19、本申请另一方面，还提出一种所述双sgrna靶向敲除igf2bp1的sgrna，在构建igf2bp1蛋白功能丧失的细胞系中的应用。
20、本申请另一方面，还提出一种经靶向敲除的igf2bp1，在人肺腺癌敲除细胞系中与hnf4α的m6a结合机制的应用。
21、本专利技术的技术效果：
22、本申请通过提供一种基于crispr/cas9技术特异性靶向敲除igf2bp1的sgrna，经慢病毒转染肺腺癌细胞系后获得稳定敲除的肺腺癌细胞株，该细胞株的转移、侵袭、克隆形成能力被显著抑制。通过，rna结合蛋白免疫沉淀(rip)和rna甲基化免疫共沉淀-qpcr(merip-qpcr)证明igf2bp1在肺腺癌细胞系中能结合hnf4a的mrna并促进其的表达。该细胞株的hnf4a的mrna稳定性也显著降低。该专利技术为抑制igf2bp1的表达逆转肺腺癌细胞的恶性特征提供了科学依据，为igf2bp1的功能研究提供了一个工具和方向。比起单靶点的设计，本专利技术主要通过设计双靶点敲除igf2bp1基因，具有高效，操作简单，低脱靶率的优势。
23、根据下面参考附图对示例性实施例的详细说明，本公开的其它特征及方面将变得清楚。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种双sgRNA靶向敲除方式敲除IGF2BP1的sgRNA，其特征在于，包含两对特异性靶向IGF2BP1的sgRNA序列，方向均为5’-3’：
2.根据权利要求1所述的一种双sgRNA靶向敲除方式敲除IGF2BP1的sgRNA，其特征在于，合成所述第一正义链：IGF2BP2-sgRNA-1所需的两条寡核苷酸(oligo)单链为：
3.根据权利要求1所述的一种双sgRNA靶向敲除方式敲除IGF2BP1的sgRNA，其特征在于，合成所述第二正义链：IGF2BP2-sgRNA-3所需的两条oligo单链为：
4.一种利用权利要求1所述双sgRNA靶向敲除技术敲除IGF2BP1的sgRNA构建得到的靶向IGF2BP1敲除的sgRNA慢病毒敲除载体。
5.一种IGF2BP1慢病毒敲除载体，采用权利要求4所述sgRNA慢病毒敲除载体，转化得到。
6.一种权利要求1所述双sgRNA靶向敲除IGF2BP1的sgRNA，在敲除IGF2BP1中基因中的应用。
7.一种权利要求1所述双sgRNA靶向敲除IGF2BP1的sgRN
8.一种经靶向敲除的IGF2BP1，在人肺腺癌敲除细胞系中与HNF4α的m6A结合机制的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种双sgrna靶向敲除方式敲除igf2bp1的sgrna，其特征在于，包含两对特异性靶向igf2bp1的sgrna序列，方向均为5’-3’：
2.根据权利要求1所述的一种双sgrna靶向敲除方式敲除igf2bp1的sgrna，其特征在于，合成所述第一正义链：igf2bp2-sgrna-1所需的两条寡核苷酸(oligo)单链为：
3.根据权利要求1所述的一种双sgrna靶向敲除方式敲除igf2bp1的sgrna，其特征在于，合成所述第二正义链：igf2bp2-sgrna-3所需的两条oligo单链为：
4.一种利用权利要求1所述双s...
【专利技术属性】
技术研发人员：王学全，杨海华，张乐乐，郭乐，丁嘉佩，
申请(专利权)人：台州恩泽医疗中心集团，
类型：发明
国别省市：
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