【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析，具体涉及一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法。
技术介绍
1、富马酸卢帕他定，属于n-烷基吡啶衍生物，是一种新型的第二代h1抗组胺药，能够选择性的、长效的拮抗外周h1受体；并且还有额外的拮抗血小板活化因子的作用。可用于成人和青少年(12岁以上)的过敏性鼻炎和荨麻疹。富马酸卢帕他定片在多个欧洲国家上市销售，最初于2003年3月在西班牙获批上市，然后于2009年9月在包括英国在内的大部分欧盟国家上市，并于2020年08月获批在国内上市。
2、目前，国内文献有报道采用液质联用测定卢帕他定及其代谢物含量的方法。例如，文献固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时测定人血浆中卢帕他定的浓度(曹靖，曾欣，周小琳(湖南省儿童医院，湖南长沙410007)，中公开了血浆中卢帕他定的检测方法，但是未检测其代谢物地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定，且检测前处理方法为固相萃取，前处理操作繁琐，卢帕他定的最低定量浓度为0.2ng/ml。
3、文献lc-ms/ms法同时测定人血浆中卢帕他定及其活性代谢产物地洛他定的浓度(张婧婧1，田媛2，张尊建2，1.江苏省疾病预防控制中心，江苏南京210009；2.中国药科大学分析测试中心，江苏南京210038)中也公开了血浆中卢帕他定及其活性代谢产物地洛他定的检测方法，但是在检测方法中使用非氘代内标艾司唑仑作内标，无法控制分析物与内标的基质效应相同，可能使样品检测结果与真实值有差距，血浆用量为1000μl，血浆用量较多不适用于大批量分
4、文献lc-ms/ms法测定人血浆中地氯雷他定及其代谢产物3-羟基地氯雷他定的浓度(刘琳琳1，许剑安2，储楠楠2，陈伟力2，徐红蓉2，李雪宁2，1.江西省南昌市第一人民医院药剂科，南昌330046；2.复旦大学附属中山医院临床医院药理室，上海200032)中也公开了血浆中地氯雷他定及其代谢产物3-羟基地氯雷他定的检测方法，但是在检测方法中血浆用量为1ml，血浆用量较多不适用于大批量分析样品,且前处理为液液萃取，需要加入氢氧化钠溶液0.15ml，乙醚6ml，然后取上清，40℃水浴中氮气吹干，该前处理较为复杂，且试剂用量较多；本专利技术的血浆用量仅为0.1ml，若是将该文献检测方法的血浆用量拟变为0.1ml，最后的进样溶液仅剩余20μl，但其进样体积为10μl，故该方法不适用；该文献检测方法中地氯雷他定及其代谢产物3-羟基地氯雷他定的最低定量浓度均为0.05ng/ml，而该专利技术中地氯雷他定以及3-羟基地氯雷他定的最低定量浓度均为0.01ng/ml；该文献检测方法中地氯雷他定低、中、高三个浓度水平的提取回收率分别为48.6％、37.1％、36.1％，3-羟基地氯雷他定低、中、高三个浓度水平的提取回收率分别为38.6％、25.2％、24.8％，本专利技术中地氯雷他定低、中、高三个弄对水平的提取回收率分别为95.66％、93.45％、94.28％，3-羟基地氯雷他定低、中、高三个浓度水平的提取回收率分别为94.08％、93.66％、94.07％；该文献检测方法中3-羟基地氯雷他定色谱峰拖尾，影响峰面积的计算。
5、为满足临床大批量样品分析评价药物生物等效性的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法以及用于检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定浓度的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小，提取回收率较高的检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定浓度的方法。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，它包括以下步骤：
4、(1)人血浆样品前处理，向人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂，然后进行离心和稀释处理；
5、(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相a和流动相b为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相a为甲醇-乙腈混合溶液，在混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为4～6:6～4；流动相b为2～20mm甲酸铵水溶液；
6、(3)人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定浓度的测定；梯度洗脱过程如下：
7、在0-0.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比为50:50；
8、在0.5-1.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由50:50匀速渐变至70:30；
9、在1.0-2.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比为70:30；
10、在2.6-3.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由70:30匀速渐变至95:5；
11、在3.0-4.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比为95:5；
12、在4.5-5.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比由95:5匀速渐变至50:50；
13、在5.0-5.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比为50:50。
14、具体的梯度洗脱过程如表1：
15、表1：卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定液相色谱梯度
16、
17、本专利技术采用hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定时，弱洗针液为甲醇，强洗针液为甲醇：乙腈：异丙醇(1:1:1，v/v/v)(0.1％甲酸)。优选的，在强洗针液中甲醇、乙腈、异丙醇和甲酸的体积比为1000:1000:1000:3。
18、本专利技术采用hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定时，在一种优选方案中，流动相a中，甲醇-乙腈的体积比为1:1。进一步地，流动相b为10mm甲酸铵水溶液。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。在流动相b中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.20％甲酸；在不影响本专利技术效果的情况下，在一种优选方案中，在流动相b中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸，即流动相b为0.1％甲酸-10mm甲酸铵水溶液。
19、本专利技术采用hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定时，采用agilent，zorbax ec本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，在梯度洗脱过程中，弱洗针液为甲醇；强洗针液为甲醇-乙腈-异丙醇-甲酸混合溶液；优选的，在强洗针液中甲醇、乙腈、异丙醇和甲酸的体积比为1000:1000:1000:3。
3.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，所述流动相A中甲醇-乙腈的体积比为1:1；所述流动相B为10mM甲酸铵水溶液；优选地，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.20％甲酸；更优选地，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸。
4.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，液相色谱条件包括：色谱柱为Agilen
5.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂，涡旋及离心后取上清液，与稀释剂混合，即得待测样品；所述内标工作液中内标为卢帕他定-d4、地氯雷他定-d5、3-羟基地氯雷他定-d4；所述沉淀剂为甲醇；所述稀释剂为甲醇和水的混合溶液，优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为40～60:6～40；更优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为50:50。
6.根据权利要求5所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，在步骤(1)中，内标工作溶液的配制如下：称取卢帕他定-d4、地氯雷他定-d5、3-羟基地氯雷他定-d4对照品，分别用甲醇溶解得到浓度为1.00mg/ml的内标储备液，再用体积比为50:50的甲醇与水混合溶液稀释得到卢帕他定-d4、地氯雷他定-d5、3-羟基地氯雷他定-d4浓度均为10.0ng/mL的内标工作液。
7.根据权利要求6所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取100μL人血浆样品，加入50.0μL内标工作液和250μL甲醇，涡旋及离心后取150μL上清液，再与50.0μL稀释剂混合后，即得待测样品；所述稀释剂中甲醇和水的体积比为50:50。
8.根据权利要求6或7所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，所述涡旋及离心的条件为：涡旋5min，在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min；将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样体积为10μL，进样器温度4℃。
9.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压3500V，离子源温度550℃；卢帕他定，[M+H]+，m/z 416.1→309.2，DP值100V，CE值26V；卢帕他定-d4，[M+H]+，m/z 420.4→284.2，DP值100V，CE值47V；地氯雷他定，[M+H]+，m/z 311.1→259.1，DP值100V，CE值31V；地氯雷他定-d5，[M+H]+，m/z 316.3→264.2，DP值100V，CE值47V；3-羟基地氯雷他定，[M+H]+，m/z 327.2→275.2，DP值100V，CE值31V；3-羟基地氯雷他定-d4，[M+H]+，m/z 331.4→279.2，DP值100V，CE值47V。
10.权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法用于临床药代动力学的样本监测。
...【技术特征摘要】
1.一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，在梯度洗脱过程中，弱洗针液为甲醇；强洗针液为甲醇-乙腈-异丙醇-甲酸混合溶液；优选的，在强洗针液中甲醇、乙腈、异丙醇和甲酸的体积比为1000:1000:1000:3。
3.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，所述流动相a中甲醇-乙腈的体积比为1:1；所述流动相b为10mm甲酸铵水溶液；优选地，在流动相b中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.20％甲酸；更优选地，在流动相b中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸。
4.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，液相色谱条件包括：色谱柱为agilent，zorbaxeclipsexdb-phenyl，该色谱柱的长度为75mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5μm；
5.根据权利要求1所述的hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂，涡旋及离心后取上清液，与稀释剂混合，即得待测样品；所述内标工作液中内标为卢帕他定-d4、地氯雷他定-d5、3-羟基地氯雷他定-d4；所述沉淀剂为甲醇；所述稀释剂为甲醇和水的混合溶液，优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为40～60:6～40；更优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为50:50。
6.根据权利要求5所述的hplc-ms/ms联用检测人血浆中卢帕他定、地氯雷他定和3-羟基地氯雷他定的方法，其特征在于，在步骤(1)中，内标工作溶液的配制如下：称取卢帕他定-d4、地氯雷他定-d5、3-羟基地...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶志莹，高倩倩，李艳静，
申请(专利权)人：南京一诺医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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