【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其涉及一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条及其制备方法。
技术介绍
1、全球范围内，肾病的发病率呈逐年上升趋势，中国作为世界上最大的发展中国家，肾病在成年人中的发病率也超过10％，有1亿多人口遭受肾病的困扰。然而临床医务工作者在实际医疗工作中却很难对早期肾病进行诊断并及时干预和治疗，主要是因为患者发生早期肾脏损伤时临床症状不显著，导致误诊和漏诊时有发生，因而延误病情。
2、临床判断肾脏损伤采用尿常规、渗透压、血肌酐、尿素氮、内生肌酐清除率等指标，但多数情况下当这些指标增高时，很多肾脏损害已经非常严重或已产生了不可逆的损伤，此外，依靠scr诊断肾损伤存在以下局限性：scr虽是肾小球滤过率(glomerμlarfiltration rate，gfr)依赖指标，但不能完全反映肾小管的损伤情况，其在血液中蓄积只与gfr降低相关，且只有当gfr下降超过50％时scr才开始升高；而且scr水平变化易受年龄、性别、种族、肌肉代谢和蛋白质摄入等因素的影响。其他指标与scr一样也存在某些缺陷。因此寻找更为特异和灵敏的肾损伤生物标志物成为医学界的研究热点之一。
3、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)是在中性粒细胞中被发现的一种分泌性小分子量蛋白，体内存在三种形态：25kd单体形式，46kd的同源二聚体，还能够与mmp-9聚合形成135kd的异源二聚体。在尿液和血液中，ngal主要以单体或二聚体的方式存在的，单体主要是由肾小管上皮细胞损伤后分泌，二聚体则是由中性粒细胞分泌。肾损伤时，n
4、当前检测ngal和kim-1的方法主要有化学发光、elisa和免疫印迹等方法，这些方法存在不同的缺点，如需要昂贵的仪器设备、检测时间长和灵敏度不高等，不适合床边诊断(poct)，难以满足临床上对ngal和kim-1进行快速便携式检测的需求，因此，开发新型的ngal和kim-1联合检测试纸条具有广阔的潜在市场前景。
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条及其制备方法，用胶体金修饰的二氧化硅纳米棒，根据lfsb的超灵敏蛋白质检测法，可视化检测复杂体系中急慢性肾损伤的生物标记物ngal和kim-1，为ngal和kim-1的简便、快速检测提供了可能。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条的制备方法，其特征在于：
4、s1：制备ngal和kim-1抗原；
5、s2：制备ngal和kim-1单克隆抗体；
6、s3：制备用于与ngal和kim-1单克隆抗体进行偶联的纳米材料；
7、s4：制备纳米材料与抗体偶联的偶联物；
8、s5：基于免疫荧光层析法制备ngal和kim-1检测试剂盒。
9、进一步的，步骤s3中所述的纳米材料为金纳米粒子装饰的二氧化硅纳米棒。
10、进一步的，金纳米粒子装饰的二氧化硅纳米棒的制备方法包括以下步骤，
11、s301：采用一步合成法制备硅胶纳米棒sinrs；
12、s302：使用haucl4溶液、k2co3和nabh4溶液制备金种子gnp；
13、s303：采用步骤s301中的硅胶纳米棒sinrs和步骤s302中的金种子gnp制备金纳米粒子装饰的二氧化硅纳米棒gnp-sinrs。
14、进一步的，步骤s4的具体操作包括以下步骤，
15、s401：将ucnps-cooh、edc、nhs加入到mes缓冲液中进行反应；
16、s402：反应30分钟后，离心纯化，沉淀重悬于硼酸缓冲液中；
17、s403：向步骤s402的硼酸缓冲液中加入anti-kim-1抗体或anti-ngal抗体并孵化2h；
18、s404：孵化后离心纯化，沉淀重悬于硼酸缓冲液中，保存于4℃备用。
19、进一步的，步骤s5的具体操作包括以下步骤，
20、s501：筛选抗原抗体配对组合；
21、s502：分别制备ngal和kim-1荧光微球抗体标记物；
22、s503：在一个结合物垫上不同位置分别对ngal和kim-1荧光微球抗体标记物进行包被；
23、s504：组板，将结合物垫、吸水纸粘贴在试纸条支持物上；
24、s505：切条、装配和置袋。
25、进一步的，步骤s501中用于ngal检测的抗原抗体配对组合包括ngal-ag1抗原和ngal-mcab3#、ngal-mcab7#抗体；
26、用于kim-1检测的抗原抗体配对组合包括kim-1抗原和kim-1-mcab2#、kim-1-mcab13#抗体。
27、进一步的，步骤s502中制备ngal荧光微球抗体标记物的具体操作包括以下步骤，
28、s5021：取0.05m硼酸-硼砂缓冲液及bangs荧光微球于离心管中，混匀；
29、s5022：超声分散，使得荧光微球均匀分散于0.05m硼酸-硼砂缓冲液中；
30、s5023：在步骤s5022的溶液中加入edc溶液活化；
31、s5024：活化完成后，置于离心机中离心，去除上清液；用0.05m硼酸-硼砂缓冲液复溶，离心洗涤两遍。
32、s5025：最后一次复溶后超声分散，加入ngal-mcab7#单克隆抗体，使得蛋白终浓度为200μg/ml，常温下置于摇床振荡；
33、s5026：加入偶联封闭液，置于摇床封闭；
34、s5027：封闭完成后，置于离心机中离心，去除上清液，用0.05m硼酸-硼砂缓冲液复溶，离心洗涤两遍；
35、s5028：最后一次离心洗涤后用偶联储存液复溶，超声分散，置于2～8℃保存待用。
36、进一步的，步骤s503中ngal荧光微球抗体标记物包被的具体操作包括以下步骤，将单克隆抗体ngal-mcab3#和羊抗鼠igg抗体包被在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线区域，将单克隆抗体ngal-mcab7#标记荧光微球并分布在玻璃纤维素膜中。
37、进一步的，kim-1荧光微球抗体标记物包被的具体操作包本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的纳米材料为金纳米粒子装饰的二氧化硅纳米棒。
3.根据权利要求2所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于，金纳米粒子装饰的二氧化硅纳米棒的制备方法包括以下步骤，
4.根据权利要求3所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤S4的具体操作包括以下步骤，
5.根据权利要求1所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤S5的具体操作包括以下步骤，
6.根据权利要求5所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤S501中用于NGAL检测的抗原抗体配对组合包括NGAL-Ag1抗原和NGAL-McAb3#、NGAL-McAb7#抗体；
7.根据权利要求5所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于
8.根据权利要求5所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤S503中NGAL荧光微球抗体标记物包被的具体操作包括以下步骤，将单克隆抗体NGAL-McAb3#和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线区域，将单克隆抗体NGAL-McAb7#标记荧光微球并分布在玻璃纤维素膜中。
9.根据权利要求8所述的一种可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条的制备方法，其特征在于，KIM-1荧光微球抗体标记物包被的具体操作包括以下步骤，将单克隆抗体KIM-1-McAb2#和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上的检测线和质控线区域，将KIM-1-McAb13#标记荧光微球分布在玻璃纤维素膜中。
10.采用如权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的可同时检测NGAL和KIM-1的试纸条。
...【技术特征摘要】
1.一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条的制备方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述的纳米材料为金纳米粒子装饰的二氧化硅纳米棒。
3.根据权利要求2所述的一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条的制备方法，其特征在于，金纳米粒子装饰的二氧化硅纳米棒的制备方法包括以下步骤，
4.根据权利要求3所述的一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤s4的具体操作包括以下步骤，
5.根据权利要求1所述的一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤s5的具体操作包括以下步骤，
6.根据权利要求5所述的一种可同时检测ngal和kim-1的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤s501中用于ngal检测的抗原抗体配对组合包括ngal-ag1抗原和ngal-mcab3#、ngal-mcab7#抗体；
7.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑义，胡波，熊传银，
申请(专利权)人：中国科学院大学深圳医院光明，
类型：发明
国别省市：
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