【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种外泌体富集支架的制备方法及其应用。
技术介绍
1、皮肤创面的再生修复仍然是一个挑战。伤口愈合是一个复杂的生物学过程，包括出血、炎症、增殖和重塑，受到各种细胞、细胞因子和细胞外基质(ecm)的影响。大量研究表明，人脐带间充质干细胞(huc-msc)具有促进组织修复的潜力，包括皮肤、肌肉和骨骼。旁分泌效应已成为这些细胞生物活性的主流理论，它是通过外泌体(exosomes)介导的，外泌体是一种由脂质双层膜包裹的亚细胞结构，大小从40nm到160nm，由大多数细胞类型释放。这些外泌体由多种生物分子组成，如蛋白质、脂质、dna、mrna和mirna，对细胞分化、增殖、血管生成、应激反应和免疫信号传导至关重要。越来越多的证据表明，间充质干细胞来源的外泌体具有加速伤口愈合的再生潜力。这些外泌体通过诱导表观遗传改变影响受体细胞，正向调节其生理状态，促进增殖或抑制凋亡，从而导致组织修复和再生。然而，由于外泌体在体内的快速清除导致生物活性降低，且分离方法复杂，成本高且耗时，因此其临床应用仍然具有挑战性。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的技术问题，提供了以下的技术方案：
2、本专利技术提供了一种外泌体富集支架的制备方法，所述制备方法包括对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架。
3、进一步，所述制备方法包括如下步骤：
4、1)壳聚糖溶于弱酸中，混
5、2)-20℃冷冻3小时，通过-80℃下冷冻干燥24小时，得到壳聚糖-海绵复合多孔支架；
6、3)对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架。
7、术语“热改性”是指使用环境温度对复合支架进行改造的过程，特指的，环境温度为高于常温的温度，“热改性”后支架的表面性质发生改变。
8、在一些实施方案中，所述恒温干燥热改性的过程持续10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min。在一些实施方案中，所述恒温温度的范围包括160℃、161℃、162℃、163℃、164℃、165℃、166℃、167℃、168℃、169℃、170℃、171℃、172℃、173℃、174℃、175℃、176℃、177℃、178℃、179℃、180℃。
9、进一步，所述步骤1)中弱酸包括乙酸、碳酸、亚硝酸、次氯酸。
10、进一步，所述步骤1)中弱酸为乙酸。
11、进一步，所述步骤1)中乙酸为1％v/v。
12、进一步，所述步骤1)中壳聚糖溶液终浓度为1％-3％。
13、在一些实施方案中，所述壳聚糖溶液终浓度为1％、1.5％、2％、2.5％、3％。
14、进一步，所述步骤1)中混匀包括搅拌混匀、震荡混匀，所述混匀时间为3h。
15、进一步，所述步骤3)中干燥包括鼓风干燥。
16、进一步，所述外泌体包括干细胞外泌体。
17、进一步，所述外泌体包括间充质干细胞外泌体。
18、进一步，所述外泌体包括细菌产生的外泌体。
19、进一步，所述外泌体包括体细胞产生的外泌体。
20、术语“外泌体”是指由体内几乎所有细胞类型分泌的内吞衍生的纳米囊泡。外泌体或外泌体样囊泡包括蛋白质、核酸(尤其是mirna)和脂质。在实践中，可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法，或由其改进的方法，分离和/或纯化外泌体或外泌体样囊泡。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为干细胞，更具体地，所述细胞为间充质干细胞。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为体细胞。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为细菌。
21、术语“支架”是指可用于将目标载荷或任何其它化合物(例如，aso)在ev(细胞外囊泡，例如，外泌体)的腔表面上或外表面上锚定至ev的分子。在某些方面中，支架包含合成分子。在一些方面中，支架包含非多肽部分。在其它方面中，支架包含天然存在于ev中的脂质、碳水化合物或蛋白质。在一些方面中，支架包含不天然存在于ev中的脂质、碳水化合物或蛋白质。可用于实施例中的其它支架的非限制性实例包括：氨基肽酶n(cd13)；脑啡肽酶，aka膜金属内肽酶(mme)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(enpp1)；神经纤毛蛋白-1(nrp1)；cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚蛋白、乳凝集素(mfge8)、lamp2和lamp2b。
22、术语“壳聚糖”是指由氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和n-乙酰葡糖胺(乙酰单位)随机分布，并透过β-(1-4)糖苷键组合而成的线性多糖。壳聚糖通过壳多糖的脱乙酰化来制备。术语“壳聚糖”涉及壳聚糖、壳聚糖衍生物以及壳聚糖与壳聚糖衍生物的混合物。
23、本专利技术提供了一种根据前面所述的制备方法制备的外泌体富集支架。
24、在一些实施方案中，所述富集是指从大量母体物质中搜集欲测定的痕量元素至一较小体积，从而提高其含量至测定下限以上的这一操作步骤。试样中含量少于0.01％的痕量物质，如果它的含量低于分析方法的测定下限，就必须采用预富集的方法。在一个具体的实施方案中，所述富集的目的物为外泌体。
25、本专利技术提供了一种富集外泌体的方法，所述方法如下的步骤：
26、1)将外泌体溶液与mes缓冲液以1:4的比例进行混合，调整ph值，然后添加前面所述的外泌体富集支架，冰上混匀，得到结合到外泌体富集支架上的外泌体；2)使用碱性溶液洗涤释放外泌体富集支架上的外泌体，得到外泌体富集产物。
27、进一步，所述ph值包括5.8-6.2。
28、在一些具体的实施方案中，所述ph值调整到5.8、5.85、5.9、5.95、6.0、6.05、6.1、6.15、6.2。
29、进一步，所述冰上混匀时间为30min，混匀方式为震荡混匀。
30、进一步，所述碱性溶液包括磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸铵、磷酸二氢铵、和/或磷酸氢二铵配制的溶液。
31、进一步，所述碱性溶液为nahco3溶液。
32、进一步，所述nahco3溶液ph值包括8.0-10.6。
33、在一些实施方案中，所述碱性溶液nahco3溶液ph值包括8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种外泌体富集支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中弱酸包括乙酸、碳酸、亚硝酸、次氯酸；
3.一种根据权利要求1或2所述的制备方法制备的外泌体富集支架。
4.一种富集外泌体的方法，其特征在于，所述方法如下的步骤：
5.一种外泌体保存运输的方法，其特征在于，所述方法将权利要求4中步骤1)结合到外泌体富集支架上的外泌体整体进行冻干，然后直接室温下运输和/或储存；
6.一种权利要求4的方法制备的组合物，其特征在于，所述组合物包括结合到外泌体富集支架上的外泌体，和/或收集到的外泌体。
7.权利要求1或2所述的制备方法在制备外泌体富集支架中的应用。
8.权利要求1或2所述的制备方法、权利要求3所述的外泌体富集支架、权利要求4所述的方法、权利要求6所述的组合物在制备产品中的应用；
9.权利要求1或2所
10.一种外泌体富集的系统或装置，其特征在于，所述系统包括权利要求1或2所述的制备方法、权利要求4所述的方法，所述制备方法或方法由计算机存储程序自动执行。
...【技术特征摘要】
1.一种外泌体富集支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中弱酸包括乙酸、碳酸、亚硝酸、次氯酸；
3.一种根据权利要求1或2所述的制备方法制备的外泌体富集支架。
4.一种富集外泌体的方法，其特征在于，所述方法如下的步骤：
5.一种外泌体保存运输的方法，其特征在于，所述方法将权利要求4中步骤1)结合到外泌体富集支架上的外泌体整体进行冻干，然后直接室温下运输和/或储存；
6.一种权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁记方，李美蓉，侯倩，付小兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：
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