【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开尤其涉及na+泄漏通道非选择性蛋白(nalcn)与fam155a(也称为fam155；序列相似性家族155成员a)、unc79(未配位79)和unc80(未配位80)的复合物，筛选调节所述复合物的活性的分子的方法以及其经鉴定的调节剂。
技术介绍
1、在许多神经元中，nalcn(na+泄漏通道非选择性)通道体有助于调节静息膜电位、自发放电和起搏活动的基础na+泄漏电流。nalcn代表四结构域离子通道超家族的一个独特分支，并且是人的孤儿基因。与远距离相关的电压门控钠(nav)和钙(cav)通道不同，nalcn不受膜电位变化的门控。异源系统中的强大活性需要其他三种蛋白质的共表达：fam155a(也称为fam155；序列相似性家族155成员a)、unc79(未配位79)和unc80(未配位80)。例如，已发现nalcn和unc80的突变会导致一系列神经发育疾病，诸如运动、精神和视觉缺陷。fam155a、unc79和unc80与典型的nav或cav通道辅助亚基没有序列相似性，表明它们提供专门的支架或功能作用。
2、最近，确定了nalcn-fam155a成孔子复合物的基本结构，并揭示了fam155a在nalcn选择性滤波器上形成整合的圆顶状结构，而s6门在不存在unc79和unc80的情况下关闭。(m.kschonsak等人,nature 587:313-318(2020)；y.kang等人,nature comm.11:6199[doi.org/10.1038/s41467-020-20002-9](2000)；j.xi
技术实现思路
1、本专利技术人现在已经成功地制备了nalcn、fam155a、unc79和unc80中所有四者的复合物，在一些实施例中，该复合物进一步含有钙调蛋白(cam)，如在下面的实例部分中更详细地描述的。并且本专利技术人通过冷冻电子显微镜以3.3-3.1埃的分辨率确定了该复合物的整体结构。例如，获得适合于功能测定法(诸如离子通道测定法)和结合亲和力测定法的这些蛋白质的复合物的能力除其他事项外允许筛选分子以鉴定复合物的调节剂和与复合物结合的分子。
2、因此，本申请包括例如一种鉴定人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、fam155(序列相似性家族155成员a)、unc79(未配位79)和unc80(未配位80)的复合物(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)的调节剂的方法，该方法包括：(a)在体外提供人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物；(b)使该复合物与该复合物的潜在调节剂接触；(c)在存在该潜在调节剂的情况下进行该复合物的离子通道测定法；以及(d)如果在存在该潜在调节剂的情况下该测定法中该复合物的活性高于或低于在不存在该潜在调节剂的情况下该测定法中该复合物的活性，则将该潜在调节剂鉴定为该复合物的调节剂。在一些情况下，离子通道测定法为膜片钳或自动膜片钳测定法、离子流测定法或者离子或电压敏感染料测定法。在一些情况下，在存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性低于在不存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性(即，潜在调节剂降低测定法中复合物的活性)。在一些情况下，在部分(c)中鉴定的潜在调节剂降低测定法中复合物的活性至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些方面，在存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性高于在不存在潜在调节剂的情况下测定法中复合物的活性(即，潜在调节剂增加测定法中复合物的活性)。在一些实施例中，该方法进一步包括确定在部分(d)中所鉴定的潜在调节剂与人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物、人nalcn-fam155复合物、unc79-unc80复合物的结合亲和力，或者与人nalcn、fam155、unc79或unc80中的一者或多者的结合亲和力。在一些情况下，潜在调节剂以10μm或更低、10μm至50nm、10μm至500nm、1μm或更低、1μm至50nm或者100nm或更低的ec50或ic50与人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合。在一些方面，该方法在存在nalcn-dii-diii接头肽或nalcn-di-dii接头肽或人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的经鉴定的调节剂的情况下进行。在一些方面，接头肽包含seq id no:16至24中任一者的氨基酸序列，或包含seq id no:16至18或23至24中任一者的氨基酸序列。在一些情况下，该方法进一步包括确定潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中该复合物包含突变型人nalcn。在一些情况下，突变型人nalcn包含在di-dii接头或dii-diii接头中的一者或两者中的取代、插入或缺失。在一些情况下，di-dii接头或dii-diii接头被来自人或哺乳动物nav或cav蛋白(诸如来自人nav1.4)的对应区域替换；包含缺失；或者包含gggs元件的插入。在一些情况下，突变型人nalcn包含seq id no:7、8、12至15、32至52或59至63中任一者的氨基酸序列。在一些方面，该方法进一步包括确定潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中该复合物包含突变型人unc79，该突变型人unc79例如包含seq id no:53、54、55、58或64至73中任一者的氨基酸序列。在一些方面，该方法进一步包括确定潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中该复合物包含突变型人unc80，该突变型人unc80例如包含seq id no:74至85中任一者的氨基酸序列。
3、本公开还包括例如一种鉴定与人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、人fam155(序列相似性家族155成员a)、人unc79(未配位79)和人unc80(未配位80)的复合物：(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)结合的分子的方法，该方法包括：(a)在体外提供人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物；(b)使该复合物与一种或多种测试分子接触，并使结合的测试分子与未结合的测试分子分离；以及(c)如果在使结合的测试分子与未结合的测试分子分离后测试分子保持与该复合物结合，则将该测试分子鉴定为与该人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合。
4、本公开还包括例如一种鉴定与人本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴定人NALCN(Na+泄漏通道非选择性)、FAM155(序列相似性家族155成员A)、UNC79(未配位79)和UNC80(未配位80)的复合物(人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物)的调节剂的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子通道测定法为膜片钳或自动膜片钳测定法、离子流测定法或者离子或电压敏感染料测定法。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性低于在不存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性(即，所述潜在调节剂降低所述测定法中所述复合物的活性)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在部分(c)中所鉴定的所述潜在调节剂降低所述测定法中所述复合物的活性至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性高于在不存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性(即，
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括确定在部分(d)中所鉴定的所述潜在调节剂与所述人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物、人NALCN-FAM155复合物、UNC79-UNC80复合物的结合亲和力，或者与人NALCN、FAM155、UNC79或UNC80中的一者或多者的结合亲和力。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述潜在调节剂以10μM或更低、10μM至50nM、10μM至500nM、1μM或更低、1μM至50nM或者100nM或更低的EC50或IC50与所述人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物结合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法在存在NALCN-DII-DIII接头肽或NALCN-DI-DII接头肽或所述人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物的经鉴定的调节剂的情况下进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述接头肽包含SEQ ID No:16至24中任一者的氨基酸序列，或包含SEQ ID No:16至18或23至24中任一者的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述潜在调节剂是否调节人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物的活性，其中所述复合物包含突变型人NALCN。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述突变型人NALCN包含在DI-DII接头或DII-DIII接头中的一者或两者中的取代、插入或缺失。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述DI-DII接头或所述DII-DIII接头被来自人或哺乳动物NaV或CaV蛋白诸如来自人NaV1.4的对应区域替换；包含缺失；或者包含GGGS元件的插入。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述突变型人NALCN包含SEQ ID No:7、8、12至15、32至52或59至63中任一者的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述潜在调节剂是否调节人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物的活性，其中所述复合物包含突变型人UNC79，所述突变型人UNC79例如包含SEQ ID No:53、54、55、58或64至73中任一者的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述潜在调节剂是否调节人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物的活性，其中所述复合物包含突变型人UNC80，所述突变型人UNC80例如包含SEQ ID No:74至85中任一者的氨基酸序列。
16.一种鉴定与人NALCN(Na+泄漏通道非选择性)、人FAM155(序列相似性家族155成员A)、人UNC79(未配位79)和人UNC80(未配位80)的复合物：(人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物)结合的分子的方法，所述方法包括：
17.一种鉴定与人NALCN(Na+泄漏通道非选择性)、人FAM155(序列相似性家族155成员A)、人UNC79(未配位79)和人UNC80(未配位80)的复合物：(人NALCN-FAM155-UNC79-UNC80复合物)结合的分子的方法，所述方法包括：
18.一种在体外鉴定调节人NALCN(Na...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种鉴定人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、fam155(序列相似性家族155成员a)、unc79(未配位79)和unc80(未配位80)的复合物(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)的调节剂的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子通道测定法为膜片钳或自动膜片钳测定法、离子流测定法或者离子或电压敏感染料测定法。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性低于在不存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性(即，所述潜在调节剂降低所述测定法中所述复合物的活性)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在部分(c)中所鉴定的所述潜在调节剂降低所述测定法中所述复合物的活性至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性高于在不存在所述潜在调节剂的情况下所述测定法中所述复合物的活性(即，所述潜在调节剂增加所述测定法中所述复合物的活性)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括确定在部分(d)中所鉴定的所述潜在调节剂与所述人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物、人nalcn-fam155复合物、unc79-unc80复合物的结合亲和力，或者与人nalcn、fam155、unc79或unc80中的一者或多者的结合亲和力。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述潜在调节剂以10μm或更低、10μm至50nm、10μm至500nm、1μm或更低、1μm至50nm或者100nm或更低的ec50或ic50与所述人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物结合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法在存在nalcn-dii-diii接头肽或nalcn-di-dii接头肽或所述人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的经鉴定的调节剂的情况下进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述接头肽包含seq id no:16至24中任一者的氨基酸序列，或包含seq id no:16至18或23至24中任一者的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中所述复合物包含突变型人nalcn。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述突变型人nalcn包含在di-dii接头或dii-diii接头中的一者或两者中的取代、插入或缺失。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述di-dii接头或所述dii-diii接头被来自人或哺乳动物nav或cav蛋白诸如来自人nav1.4的对应区域替换；包含缺失；或者包含gggs元件的插入。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述突变型人nalcn包含seq id no:7、8、12至15、32至52或59至63中任一者的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中所述复合物包含突变型人unc79，所述突变型人unc79例如包含seq id no:53、54、55、58或64至73中任一者的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述潜在调节剂是否调节人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物的活性，其中所述复合物包含突变型人unc80，所述突变型人unc80例如包含seq id no:74至85中任一者的氨基酸序列。
16.一种鉴定与人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、人fam155(序列相似性家族155成员a)、人unc79(未配位79)和人unc80(未配位80)的复合物：(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)结合的分子的方法，所述方法包括：
17.一种鉴定与人nalcn(na+泄漏通道非选择性)、人fam155(序列相似性家族155成员a)、人unc79(未配位79)和人unc80(未配位80)的复合物：(人nalcn-fam155-unc79-unc80复合物)结合的分子的方法，所述方法包括：
18.一种在体外鉴定调节人nalcn(na...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·MD·帕安德，S·A·普莱斯，谢翰超，M·克尚萨克，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：
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