【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及基因工程疫苗技术，具体涉及一种可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的双抗原mrna狂犬病疫苗、其构建以及在狂犬病防治中的应用。
技术介绍
1、狂犬病是一种人畜共患病，出现临床症状后死亡率几乎为100％，是已知最致命的传染病之一。狂犬病病毒复制迅速，能够在几天内麻痹宿主的中枢神经系统，但通过较早并及时的进行暴露前或暴露后疫苗接种可对其进行预防。因此要求接种的疫苗必须立即产生较强的免疫反应，这既包括体液免疫反应以产生足够的狂犬病病毒中和抗体，从而在病毒到达中枢神经系统之前将其中和；也包括诱导细胞免疫应答以清除病毒感染的细胞。虽然狂犬病病毒的清除依赖于抗体，但t细胞驱动的机制有助于控制病毒复制，特别是通过浸润t细胞产生的ifn-γ来介导。在中枢神经系统中，既需要能够抑制病毒复制的先天性免疫应答，也需要具有活性的可彻底清除病毒的浸润性狂犬病病毒特异性t细胞和b细胞。据先前报道证明，狂犬病疫苗接种过程，无论是在暴露前还是暴露后，均会刺激细胞免疫反应。其中，th1型细胞分泌的细胞因子ifn-γ、il-2和tnf-α，在抗病毒免疫方面很重要，它们可促进cd8+t细胞与树突状细胞的相互作用，并帮助b细胞产生高亲和力的中和抗体。而th2型细胞分泌的细胞因子(如il-4、il-5和il-13)对于b细胞介导的体液免疫反应也发挥着关键作用。
2、近年来，随着mrna疫苗技术的成熟，不少国家研发的狂犬病mrna疫苗已进入了临床前或临床试验阶段，例如德国curevacag公司开发的进入临床i期的cv7202，珠
技术实现思路
1、目前尚没有疫苗生产企业在靶向性诱导t细胞免疫应答方面展开探索，尤其是探索细胞毒性t淋巴细胞介导的针对病毒感染细胞发挥的清除作用。
2、出于通过双重免疫提升免疫保护效果的研究兴趣，本课题组致力于开发一种既可快速诱导体液免疫应答、也可激起较强细胞免疫应答的狂犬病疫苗，该疫苗可实现在感染部位快速抑制病毒复制以预防和控制狂犬病病毒的传播，尤其是在接种早期或暴露后接种时能够更快诱导机体的应答反应。那么在保证有效性的前提下，可同时靶向体液免疫和细胞应答强效疫苗的设计，需满足可使b细胞免疫原和t细胞免疫原的表位有效的加工和递呈，以便最大程度诱导中和抗体的产生、并激活t细胞发挥免疫保护。若只将b细胞免疫原和t细胞免疫原进行简单的融合表达，难以发挥其最大效果，那么就需满足在诱导特异性细胞免疫应答的作用时对可诱导产生中和抗体的体液免疫应答无显著性影响。
3、简言之，本专利技术所解决的技术问题是：本专利技术提供一种既可快速诱导体液免疫应答、也可激起细胞免疫应答的双免疫原组合物。其中，诱导体液免疫应答的b细胞免疫原来源于狂犬病病毒糖蛋白(g)，激起细胞免疫应答的t细胞免疫原来源于聚合酶大蛋白(l)，并将二者装载到同一载体上，使2个免疫原彼此间应答相互无干扰，从而实现对狂犬病有效的预防和/或治疗。
4、为解决该技术问题，本专利技术提供了一种双免疫原组合物，其可以简单、方便地同时高效表达两个外源基因，应用于疫苗制备时，疫苗具有良好的免疫原性，在免疫机体后既可快速形成强效的免疫保护，又可诱导较强的细胞免疫应答，且生产成本低、制备技术操作简便，适用于快速高效、规模化的各类疫苗制备，具有巨大的开发潜力。
5、具体而言，本专利技术包括如下技术方案：
6、提供一种免疫原组合物，其含有：狂犬病毒结构蛋白糖蛋白(g)作为活化中和抗体的免疫原；聚合酶大蛋白l作为诱导细胞免疫应答的t细胞免疫原。
7、上述的免疫原来自广泛流行的、包括不同基因型的狂犬病毒毒株，包括但不限于巴斯德毒株中的pitman-moore(pm)株、pasteur(pv)株，ctn株、ag株、flury-lep株、evelyn-rokitnicki-abelseth(era)株、street-alabama-duffering(sad)株、及其相关病毒khuv(khujandlyssavirus)、bblv(bokelohbatlyssavirus)、arav(aravanlyssavirus)、eblv-1(europeanbat1lyssavirus)、eblv-2(europeanbat2lyssavirus)、irkv(irkutlyssavirus)、lbv(lagosbatlyssavirus)、shibv(shimonibatlyssavirus)、mokv(mokolalyssavirus)、wcbv(westcaucasianbatlyssavirus)、ikov(ikomalyssavirus)、duvv(duvenhagelyssavirus)、ablv(australianbatlyssavirus)、gblv(gannoruwabatlyssavirus)或llebv(lleidabatlyssavirus)等毒株。
8、采用的获得上述t细胞抗原序列的方法包括下述步骤：
9、i.对狂犬病病毒的多种l蛋白(large protein)的氨基酸序列进行序列相似性比对；
10、ii.对所得相似性序列信息进行t细胞表位预测，获得具有免疫原性的保守区域信息。包括通过使用在线工具预测l蛋白中可能与hla超型分子强结合的多肽，即可能被呈递的多肽；
11、iii.根据所述保守区域信息设计并制备成不同的免疫原序列或多肽序列。包括将这些多肽映射到对应的靶标l蛋白中，并进一步综合分析不同疫苗株之间的富集区，找到富集区域后，将其截短形成l蛋白重组免疫原氨基酸序列l蛋白，如seq id no:5所示。
12、iv.对所得的免疫原序列或编码序列或将其与共表达(例如融合表达或单独表达)的其他序列进行组合，所述其他序列如可产生体液免疫应答的抗原序列。
13、通过上述研究，本专利技术提供的技术方案包括如下内容：
14、一种狂犬病疫苗免疫原组合物，其为蛋白质形式免疫原组合物或者dna形式免疫原组合物，所述dna是编码所述蛋白质的基因，其中，
15、所述蛋白质形式免疫原组合物包括：
16、a.作为活化中和抗体的体液免疫原(简称“抗体免疫原”)的狂犬病病毒结构蛋白糖蛋白g，简称“狂犬病病毒g蛋白”，用于诱导体液免疫应答，和
17、b.作为诱导细胞免疫应答的t细胞免疫原(简称“细胞免疫原”)的聚合酶大蛋白l，用于诱导细胞免疫应答；
18、所述dna形式免疫原组合物包括：
19、a.编码上述a项的狂犬病病毒结构蛋白糖蛋白g的核酸分子a，和
20、b.编码上述b项的聚合酶大蛋白l的核酸分子b。
21、上述的狂犬病疫苗免疫原组合物中，所述狂犬病病毒结构蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种狂犬病疫苗免疫原组合物，其为蛋白质形式免疫原组合物或者DNA形式免疫原组合物，所述DNA是编码所述蛋白质的基因，其中，
2.如权利要求1所述的狂犬病疫苗免疫原组合物，其特征在于，所述狂犬病病毒结构蛋白糖蛋白G是糖蛋白G全长氨基酸序列、其胞外区氨基酸序列或其抗原性片段，
3.如权利要求2所述的狂犬病疫苗免疫原组合物，其特征在于，
4.如权利要求1-3中任一项所述狂犬病疫苗免疫原组合物在制备狂犬病疫苗中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将权利要求1中所述的核酸分子a和核酸分子b插入到表达载体，构成载体疫苗，所使用的载体选自下组：核酸疫苗载体即mRNA载体和DNA质粒载体；重组病毒载体；重组细菌载体。
6.一种可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的狂犬病疫苗，通过如权利要求5中所述的应用方式获得，其特征在于，为核酸疫苗、腺病毒载体疫苗或者灭活细胞疫苗。
7.如权利要求6所述的狂犬病疫苗，其特征在于，其为mRNA疫苗，是将权利要求1中所述的核酸分子a和核酸分子b插入到mRNA载体中而形成的狂犬
8.如权利要求7所述的狂犬病疫苗，其特征在于，所述狂犬病疫苗是双抗原mRNA狂犬病疫苗，mRNA表达载体包含的序列从5‘端到3’端依次为T7启动子、UTR序列、第一蛋白质结构域G蛋白、IRES序列、第二蛋白质结构域重组L蛋白、降解结构域、3’-UTR序列、聚腺苷酸尾序列和单酶切位点。
9.如权利要求8所述的狂犬病疫苗，其特征在于，所述狂犬病疫苗是双抗原mRNA狂犬病疫苗，并且是化学修饰型的mRNA疫苗，所述修饰型包括利用以下物质置换所述mRNA疫苗骨架中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶，置换尿嘧啶的物质选自下述化合物：尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。
10.如权利要求6-9中任一项所述的狂犬病疫苗，其特征在于，除了包含免疫原主体外，还包括一种以上医药学上或兽医学上可接受的载剂或赋形剂，所述载剂或赋形剂优是使得狂犬病疫苗适用于经口、皮内、皮下、肌内或鼻内施用的载剂或赋形剂。
...【技术特征摘要】
1.一种狂犬病疫苗免疫原组合物，其为蛋白质形式免疫原组合物或者dna形式免疫原组合物，所述dna是编码所述蛋白质的基因，其中，
2.如权利要求1所述的狂犬病疫苗免疫原组合物，其特征在于，所述狂犬病病毒结构蛋白糖蛋白g是糖蛋白g全长氨基酸序列、其胞外区氨基酸序列或其抗原性片段，
3.如权利要求2所述的狂犬病疫苗免疫原组合物，其特征在于，
4.如权利要求1-3中任一项所述狂犬病疫苗免疫原组合物在制备狂犬病疫苗中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将权利要求1中所述的核酸分子a和核酸分子b插入到表达载体，构成载体疫苗，所使用的载体选自下组：核酸疫苗载体即mrna载体和dna质粒载体；重组病毒载体；重组细菌载体。
6.一种可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的狂犬病疫苗，通过如权利要求5中所述的应用方式获得，其特征在于，为核酸疫苗、腺病毒载体疫苗或者灭活细胞疫苗。
7.如权利要求6所述的狂犬病疫苗，其特征在于，其为mrna疫苗，是将权利要求1中所述的核酸分子a和核酸分子b插入到mrna载体中而形成的狂犬病疫苗，插入后的mrna表达载体中，从5’到3’端依次为t7启动子区、5′端非翻译区、编码序列、3′端非编码区、多聚腺苷酸尾(poly a)序列和单酶切位点，其中编码序列为免疫原编码区，在n端至c端方向上包含第一蛋白质序列、内部核糖体进入位点序列、第二蛋白质序列和降解结构域，其中所述第一蛋白质序列是狂犬病病毒结构蛋白糖蛋白g编码序列和聚合酶大蛋白l编...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐建青，张晓燕，白诗梦，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：
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