【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞冻存，具体为一种免疫细胞冻存液及冻存方法。
技术介绍
1、生物免疫细胞治疗通过体外培养、增殖、激活，回输体内即可诱导自体抗病毒免疫应答，人体抗病毒免疫一旦被激活就会源源不断产生抗病毒的物质杀灭病毒。有杀伤肿瘤细胞作用的t细胞经激活后在体内大多数变为记忆细胞储存在淋巴组织内，为彻底清除肿瘤细胞和防治转移复发提供了长期保护。随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，对于患者的治疗相当有利。但细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，需要在冻存前加入冻存保护剂，在溶解后再将其去除。目前最常用的冻存液为二甲基亚砜，这种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。但高浓度dmso具有细胞毒性，还必须添加其他的液体成分，如胎牛血清、细胞培养基，以降低dmso的浓度，减少对细胞的伤害。
2、经检索，中国专利公开号为cn106665559b的专利公开了免疫细胞冻存液及其应用，其中，该免疫细胞冻存液包含：2-10体积％的dmso；2-15体积％的hsa；20-88体积％的血浆，以及可选的加入白酒草皂苷r；以及余量培养基。该冻存液能够有效保存免疫细胞，并且保存时间长，细胞复苏后恢复能力强，细
3、目前，市面上的免疫细胞冻存液多以胎牛血清、高比例dmso、患者自体血浆、非临床应用级试剂配制而成，而动物血清有引入动物病原菌污染的潜在危险，dmso具有一定的毒性，在冷冻免疫细胞时使免疫细胞存活率较低。鉴于此，我们提出一种免疫细胞冻存液及冻存方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种免疫细胞冻存液及冻存方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种免疫细胞冻存液，其组分包括：聚乙烯醇0.01～0.03mg/m、二甲基亚砜0.03～0.07mg/m、聚乙二醇0.01～0.03mg/m、人血白蛋13～18mg/m、γ-干扰素0.03～0.07mg/m、细胞平衡液0.1～0.3mg/m、细胞稳定液2～10mg/m、氨基酸10～16mg/m、保护液5～10mg/m和细胞培养基。
4、优选的，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或几种组合。
5、优选的，所述细胞稳定液包含有维生素c、维生素e、胰岛素-转铁蛋白-硒、重组人白介素2、重组人白介素4和还原性谷胱甘肽。
6、优选的，所述细胞稳定液中各组分在免疫细胞冻存液中的含量为20～300μg/ml的维生素c、50～350μg/ml的维生素e、15～55μl/ml的胰岛素-转铁蛋白-硒、50～350u/ml的重组人白介素2、30～400u/ml的重组人白介素4、0.5～2mg/ml的还原性谷胱甘肽。
7、优选的，所述细胞培养基为imdm培养基、rpmi-1640培养基或mccoy5a培养基。
8、优选的，所述的细胞平衡液是格氏液或乳酸钠林格氏液中的一种。
9、优选的，所述保护液为海藻糖、右旋糖酐、葡萄糖和羟乙基淀粉中的一种或多种组合。
10、一种免疫细胞冻存液的冻存方法，包括以下步骤：
11、s1、采用全血提取免疫细胞；
12、s2、将提取的免疫细胞按比例加入配制的免疫细胞冻存液，并放入到4～8℃的环境中保存2～3小时进行预冷；
13、s3、将装有免疫细胞的冻存液在预冷步骤完成后，再以3～5℃/h的速率降温至零下80℃冻存，在零下80℃冻存一段时间后转入到液氮中进行保存，即将免疫细胞冻存。
14、优选的，所述步骤s2中每1000～1500万iu免疫细胞中加入1.5～2.5ml免疫细胞冻存液。
15、优选的，所述步骤s3中免疫细胞冻存液在零下的80℃冻存时间为2～3小时。
16、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
17、该免疫细胞冻存液及冻存方法，其冻存液采用无血清、无dmso冻存液，可避免了引入有害成分，使得在临床应用中更加安全可靠，通过采用聚乙烯醇、二甲基亚砜和聚乙二醇，可有效改变细胞膜的通透性，使细胞内的自由水排除细胞外，减少在冻存过程中细胞内形成冰晶对细胞造成损害，提高了免疫细胞的冻存复苏率，其采用较安全的组分，减少了破坏细胞活性的潜在危险，且本专利技术的免疫细胞冻存液中不存在抗体、补体等成分，杂蛋白少，减少对免疫细胞的活性影响。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：聚乙烯醇0.01～0.03mg/m、二甲基亚砜0.03～0.07mg/m、聚乙二醇0.01～0.03mg/m、人血白蛋13～18mg/m、γ-干扰素0.03～0.07mg/m、细胞平衡液0.1～0.3mg/m、细胞稳定液2～10mg/m、氨基酸10～16mg/m、保护液5～10mg/m和细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或几种组合。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述细胞稳定液包含有维生素C、维生素E、胰岛素-转铁蛋白-硒、重组人白介素2、重组人白介素4和还原性谷胱甘肽。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述细胞稳定液中各组分在免疫细胞冻存液中的含量为20～300μg/ml的维生素C、50～350μg/ml的维生素E、15～55μl/ml的胰岛素-转铁蛋白-硒、50～350U/ml的重组人白介素2、30～400U/ml
5.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述细胞培养基为IMDM培养基、RPMI-1640培养基或McCoy5A培养基。
6.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述的细胞平衡液是格氏液或乳酸钠林格氏液中的一种。
7.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述保护液为海藻糖、右旋糖酐、葡萄糖和羟乙基淀粉中的一种或多种组合。
8.一种根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的免疫细胞冻存液的冻存方法，其特征在于：所述步骤S2中每1000～1500万IU免疫细胞中加入1.5～2.5ml免疫细胞冻存液。
10.根据权利要求8所述的免疫细胞冻存液的冻存方法，其特征在于：所述步骤S3中免疫细胞冻存液在零下的80℃冻存时间为2～3小时。
...【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：聚乙烯醇0.01～0.03mg/m、二甲基亚砜0.03～0.07mg/m、聚乙二醇0.01～0.03mg/m、人血白蛋13～18mg/m、γ-干扰素0.03～0.07mg/m、细胞平衡液0.1～0.3mg/m、细胞稳定液2～10mg/m、氨基酸10～16mg/m、保护液5～10mg/m和细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或几种组合。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述细胞稳定液包含有维生素c、维生素e、胰岛素-转铁蛋白-硒、重组人白介素2、重组人白介素4和还原性谷胱甘肽。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞冻存液，其特征在于：所述细胞稳定液中各组分在免疫细胞冻存液中的含量为20～300μg/ml的维生素c、50～350μg/ml的维生素e、15～55μl/ml的胰岛素-转...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨美中，俞英豪，胡欢，唐江伟，
申请(专利权)人：浙江三誉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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