【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于真菌检测，具体涉及一种隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及应用。
技术介绍
1、隐球菌是一种特殊的致病真菌，可感染具有免疫活性的个体并引起大规模疫情，其经常进入呼吸道并迅速传播到大脑，导致患者死亡。自1999年在加拿大首次爆发并报告以来，隐球菌迅速蔓延到美国西太平洋地区。目前，六大洲70多个国家报告了这种真菌引起的感染。大约四分之一的患者出现脑播散，如果没有及时的抗真菌治疗，死亡率接近100％，这对隐球菌的全球控制和预防提出了严峻挑战。因此快速准确地检测隐球菌对于控制隐球菌的传播至关重要目前已知隐球菌有两种亚型属于人类病原体：新型隐球菌(neo)和罕见的格特隐球菌(gat)，占比近100％。不同的隐球菌亚型表现出不同的致病机制，需要临床医生制定区别化的治疗方案。因此，准确识别隐球菌亚型对于辅助指导精确治疗具有重要意义。
2、隐球菌核酸检测的成功与否取决于其dna的提取和扩增。然而，由于真菌具有坚韧的细胞壁和厚的多糖荚膜(占病原体体积的50％以上)，传统方法需要大量时间来裂解隐球菌以富集核酸。这些方法主要包括机械裂解、热裂解和化学裂解。此外，核酸扩增的传统方法主要是基于聚合物链式反应(pcr)，该技术需要依赖于训练有素的技术人员在专业实验室操作昂贵的仪器。因此，这些要求为在经济落后或技术落后的地方检测隐球菌感染带来了极大的障碍。文献资料《基于rgo/aunps复合纳米材料构建“三明治”结构电化学dna传感器用于病毒核酸的检测》公开了一种用rgo/aunps纳米材料制备的电极来检测病毒核酸，该文献
3、综上所述，有必要提出一种新的针对隐球菌快速准确检测的策略，以补充现有技术的不足。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏电化学核酸检测微平台及检测方法，具体技术方案如下。
2、一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏度电化学检测的微平台，所述微平台包括一种集成微流控芯片、外接电源、进样系统和/或显像系统；所述集成微流控芯片包括电裂解区、电化学检测区和电极阵列区；
3、所述电裂解区由样本入口、微流道、电极对和电穿孔流道组成，所述电极对设置在所述集成微流控芯片的底部，由多个两两交叉排列的电极竖直设置，所述电穿孔流道为多个横向蛇形排列的中空流道，设置在所述电极对的上方与所述电极对键合而成，其中每两个电穿孔流道相互连接处为电穿孔裂解处，所述电穿孔裂解处与所述电极对两两交叉排列处(中间细窄位置)相对应；
4、所述电裂解区和所述电化学检测区通过微流道连接；
5、所述电化学检测区由工作电极、参比电极和对电极组成，所述工作电极上修饰有rgo/aunps纳米材料和分子探针，所述分子探针为核酸序列，其一端连接有巯基与所述rgo/aunps纳米材料连接，另一端连接有亚甲基蓝(mb)。
6、所述集成微流控芯片电极均是由磁控溅射的方法溅射的铬和金，只有工作电极上面会再修饰纳米材料和分子探针。
7、所述微平台还包括外接电源、进样系统和/或显像系统，其中外接电源为直流高压电源；进样系统包括注射泵控制器、注射泵执行单元、注射器、移液器等，用于注入样品和控制注入样品的速度；显像系统可以是一种共聚焦显微镜，用于在电裂解前和/或电裂解后对菌体进行染色观察。所述微平台还可以包括一种检测系统。
8、进一步，所述电穿孔裂解处的长度为50-500μm，所述电穿孔裂解处的数量为1-36个。
9、进一步，所述电极对为6组；所述电穿孔裂解处的数量为6-36个。
10、进一步，所述工作电极上修饰的rgo/aunps纳米材料中rgo与aunps的体积比为4:1。
11、进一步，所述电化学检测区的工作电极的数量为1-3个(每一个工作电极上修饰有不同序列的分子探针)。
12、如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述分子探针包括seq id no.1～no.3所示的任一序列。
13、一种利用电化学检测隐球菌核酸浓度的方法，应用于上述微平台，包括以下步骤：
14、s01：将样本通过集成微流控芯片的样本入口加入，所述样本通过集成微流控芯片微流道进入电穿孔流道；
15、s02：通过外接电源对所述微流控芯片施加1-15v电压，使所述样本在电穿孔流道的电穿孔裂解处被电场裂解，释放出胞内dna；
16、具体来说，先用外接直流恒压电源连接电极阵列区最上面的两个电极，当样本通过电穿孔裂解区后流到电化学检测区待反应完成(最短用时15min)，接着用电化学工作站分别测试三个工作电极的信号。
17、s03：被电裂解后的样本通过微流道进入电化学检测区与该区域中工作电极上的分子探针序列发生互补配对，配对成功后的分子探针上连接的亚甲基蓝离开工作电极表面，从而使电流信号降低；
18、s04：对工作电极进行差示脉冲伏安法(dpv)测试，得到峰电流信号值。
19、进一步，将已知亚型的不同浓度的隐球菌样本加入到集成微流控芯片中进行检测，根据得到的不同dpv电流与所述隐球菌样本的dna浓度对数之间的校准曲线，得到电信号与样品浓度之间的拟合方程。
20、进一步，将未知浓度的待测样本加入到集成微流控芯片中进行检测，根据电流值得到所述待测样本中隐球菌的核酸浓度和亚型。
21、进一步，所述s03中，根据电流信号降低的程度判断样本中是否含有隐球菌(电流信号降低信噪比s/b>3时判定为样本中含有隐球菌)；以及，所述s04中根据得到的电流信号值判断隐球菌的亚型。
22、有益技术效果
23、本专利技术提供了一种新型基于不可逆电穿孔的集成微流控芯片，可实现快速裂解菌体，提取菌体样本dna，以及灵敏检测不同细菌/真菌亚型。总体来说，该集成芯片是将样品制备和结果量化集成在一个设备中，实现了高效准确的“样品进，结果出”的目标。
24、具体来说，本专利技术的微平台首先利用电穿孔通过模拟高电场的瞬态作用来破坏隐球菌荚膜。利用将电场强度几何放大原理，本专利技术进一步设计了用于高效裂解的蛇形微流道，显著提高了裂解效率。整个过程在封闭的环境中进行，避免了对周围环境和操作员的污染，减轻了人员、时间和地点的负担。由于该集成芯片提供了高灵敏度快速电化学检测、快速隐球菌裂解和核酸提取相结合的工作平台，其在资源有限的地区对隐球菌病进行快速准确的检测具有广泛的潜力。
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1.一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏度电化学检测的微平台，其特征在于，所述微平台包括一种集成微流控芯片、外接电源、进样系统和/或显像系统；所述集成微流控芯片包括电裂解区、电化学检测区和电极阵列区；
2.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电穿孔裂解处的长度为50-500μm，所述电穿孔裂解处的数量为1-36个。
3.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电极对为6组；所述电穿孔裂解处的数量为6-36个。
4.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述工作电极上修饰的rGO/AuNPs纳米材料中rGO与AuNPs的体积比为4:1。
5.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电化学检测区的工作电极的数量为1-3个。
6.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述分子探针包括SEQID NO.1～NO.3所示的任一序列。
7.一种利用电化学检测隐球菌核酸浓度的方法，应用于权利要求1-6任一项所述的微平台，其特征在于，包括以下步骤：
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将已知亚型的不同浓
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步将未知浓度的待测样本加入到集成微流控芯片中进行检测，根据电流值得到所述待测样本中隐球菌的核酸浓度和亚型。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述S03中，根据电流信号降低的程度判断样本中是否含有隐球菌；以及，所述S04中根据得到的电流信号值判断隐球菌的亚型。
...【技术特征摘要】
1.一种用于隐球菌快速电裂解与高灵敏度电化学检测的微平台，其特征在于，所述微平台包括一种集成微流控芯片、外接电源、进样系统和/或显像系统；所述集成微流控芯片包括电裂解区、电化学检测区和电极阵列区；
2.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电穿孔裂解处的长度为50-500μm，所述电穿孔裂解处的数量为1-36个。
3.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电极对为6组；所述电穿孔裂解处的数量为6-36个。
4.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述工作电极上修饰的rgo/aunps纳米材料中rgo与aunps的体积比为4:1。
5.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述电化学检测区的工作电极的数量为1-3个。
6.如权利要求1所述的微平台，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：董再再，孔祥珠，程龙，常凌乾，王杨，薛新颖，黄叶梅，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：
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