【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，属于生物化学领域。
技术介绍
1、脂肪酶（ec 3.1.1.3）能在较低温度下催化油脂水解，具有作用条件温和、高效、无毒、水解产物容易回收等优点，被广泛应用于动物皮脱脂、洗涤剂、废水处理等领域。
2、但是，脂肪酶是独特的酯键水解酶，其作用的底物主要为不溶于水的油脂（高级脂肪酸甘油酯）；在水相环境中，水溶性的脂肪酶在油（底物）-水界面催化底物发生水解，具有有机-无机非均相反应和油-水界面激活的特性。同时，油脂水解产生的脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯同样不具有水溶性，容易在原位发生富集；当水解产物浓度达到一定程度，脂肪酶与油脂分子被隔离，酶失去活性，因此，油脂的水解率一般不超过60%，实现去除油脂水解产物对脂肪酶的抑制作用，是提高油脂水解率的核心技术。
3、长期以来，关于提升脂肪酶对油脂水解催化效率的研究主要集中在利用表面活性将油酸乳化以期望解除其对油脂水解和脂肪酶催化的抑制效果是近年来的探索方向。然而，尽管受其结构和hlb值等因素的影响，表面活性剂对不同有机物的乳化性能的有一定差异，但常见表面活性剂对油相体系中的三酸酯、甘油二酸酯、甘油单酸酯和油酸等组分并不具有“专一性”。而且，在乳化过程中，表面活性剂分子容易在油脂表面富集而将其乳化，也会阻断脂肪酶分子与底物的接触而起不到催化作用。由于长期以来缺少可以直接观察的手段，表面活性剂的分子结构、hlb值、用量、使用方式等因素对油脂的油水界面性质、脂肪酶在油水界面上的反应性质等的影响规律并不明确，这是导致脂肪酶
4、此外，提高体系ph值使油酸皂化溶解是破坏油脂水解平衡促进其进一步水解的有效方法，而且新生成的脂肪酸钠对未能水解的油脂也具有一定的“自乳化”效果；事实上，在实际应用中发现，通过构建恰当的“酶-碱协同作用技术”能有效提高动物皮的整体脱脂率。但是，ph值的变化影响了脂肪酶的活力，而且这种“自乳化”效果也会影响酶与底物的有效接触，所以其改善程度严格受到脂肪酶活力性质的影响。为了构建更具实用价值的脂肪酶催化油脂水解技术，仍需要进一步研究体系酸碱度等因素对脂肪酶在油水界面性质的反应性能影响，这对脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究技术具有迫切的需求。
5、目前的研究中，大多通过测定油-水体系中脂肪酶蛋白的活性，反应后油-水体系中酸值的差异，脂肪酶蛋白在与油脂反应前后的结构变化，反应后油-水体系中脂肪酸种类及含量的差异，脂肪酶在油-水界面中的溶解度等间接方法，来评价水相环境中脂肪酶催化油脂水解时与油脂间的相互作用，对脂肪酶油-水界面催化的影响机制还缺乏更加客观的认识，很难指导脂肪酶高效催化技术取得了本质突破。因此，有必要建立一种直观的可视化研究方法。
6、本专利技术的研究表明，控制好合适的油-水-脂肪酶比例，选择合适的荧光素对脂肪酶蛋白进行标记，通过合适的条件控制后，能在荧光显微镜下清楚地观察到脂肪酶在油水界面的富集规律；而且，通过该方法，能观察到脂肪酶在油水界面的富集规律受乳化时间、温度、ph值、盐浓度、表面活性剂等因素的影响规律。
7、所以，构建脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，能有助于研究脂肪酶在水相环境中的催化规律，为进一步推动脂肪酶应用技术的研究具有重要科学价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有研究手段的不足，提供的一种脂肪酶在油-水界面反应性质的可视化研究方法，能直观评价环境温度、ph值、浓度、表面活性剂及其结构和种类等因素对脂肪酶在油水界面的反应性能，能更有效推动脂肪酶高效催化关键技术及原理的研究。
2、本专利技术的特点是首先采用荧光素标记脂肪酶蛋白，在不同油-水比条件下，将脂肪酶蛋白与油脂乳浊液充分接触，然后利用荧光显微镜观察、分析脂肪酶在油水界面的反应性能，实现脂肪酶在不同条件下作用规律的可视化。
3、可实现本专利技术上述目的脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，包括以下操作步骤，各操作步骤所用材料除非特别说明均按质量份计：
4、（1）油-水乳浊液的准备：于乳化管中称取1份油脂，加入1-100份ph值1.0-14.0的缓冲液，于15-70 °c条件下搅拌0.5-60分钟，每分钟搅拌10-1000转，得到充分分散的油脂乳浊液；
5、（2）脂肪酶在油水界面的反应：在步骤（1）的油脂乳浊液中加入0.01-10.0ml浓度为0.01mg/ml-100.0mg/ml经过荧光标记后的脂肪酶溶液，继续于15-70 °c条件下搅拌0.5-60分钟，每分钟搅拌10-1000转，使脂肪酶与油脂表面充分接触，得到油-水-荧光标记脂肪酶混浊液；
6、（3）脂肪酶在油水界面反应性质的观察：将步骤（2）得到的油-水-荧光标记脂肪酶混浊液在15-70 °c下静置0至60分钟，然后吸取1-100 μl滴在干净的载玻片上，使液滴直径为0.1-1.0 cm，静置0-300 s，然后利用荧光显微镜，调整放大倍数为4-4000倍，分别在荧光激发波长及可见光条件下拍照、观察、分析脂肪酶在油-水界面上的反应规律。
7、在上述技术方案中，步骤（1）和步骤（2）可以合并，即可以将油脂、水、脂肪酶一起进行搅拌乳化。
8、在上述技术方案中，脂肪酶应该标记物可以是异硫氰酸荧光素、7-氨基-4-甲基香豆素、5-羧基荧光素、二甲氨基萘磺酰氯、四甲基罗丹明 5-甲酰胺-(6-叠氮基己基)、生物素中的至少一种。
9、在上述技术方案中，所用脂肪酶是来源于动物、植物、微生物中的至少一种。
10、在上述技术方案中，所用油脂为动物油脂、植物油脂、合成油脂、矿物油脂、微生物油脂、酯中的至少一种。
11、在上述技术方案中，所用缓冲液以是任何缓冲液，特别是水、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐缓冲液。
12、在上述技术方案中，该方法也可以用于研究水相环境中，脂肪酶、蛋白纤维、油脂三者之间的相互作用规律。
13、在上述技术方案中，该方法也可以用于研究脂肪酶分布在动物皮内的油脂界面反应性能研究。
14、在上述技术方案中，该方法也可以用于研究水相环境中，研究表面活性剂、酸碱度、中性盐、酸、碱、蛋白质、氨基酸、树脂对脂肪酶在油水界面反应性质的影响规律。
15、在上述技术方案中，均匀滴加在载波片上的液滴为3~4滴，观察时间在10min以内，防止液滴干涸后图像发生变化。
16、在上述技术方案中，应保证界面内油滴边缘清晰，形状为规律的圆形或椭圆形，界面内应包含至少5个及以上油滴样本，保证实验可信度。
17、本专利技术优点的如下。
18、能直观观察和分析脂肪酶在油-水界面的反应性能，能更加直观分析不同油脂在水相环境中的界面特点。
19、能更加直观研究不同脂肪酶对各种油脂底物的亲和性差异，能更加直观分析ph、温度、盐浓度、油水比例、脂肪酶用量、表面活性剂等因素对脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，所述方法能直接观察脂肪酶在油水界面的反应性质，包括以下步骤，各操作步骤所用材料除非特别说明均按质量份计：
2.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）可以合并，即可以将油脂、水、脂肪酶一起进行搅拌乳化。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，脂肪酶应该标记物可以是异硫氰酸荧光素、7-氨基-4-甲基香豆素、5-羧基荧光素、二甲氨基萘磺酰氯、四甲基罗丹明 5-甲酰胺-(6-叠氮基己基)、生物素中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，所用脂肪酶是来源于动物、植物、微生物中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，所用油脂为动物油脂、植物油脂、合成油脂、矿物油脂、微生物油脂、酯中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究
7.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，该方法也可以用于研究水相环境中，脂肪酶、蛋白纤维、油脂三者之间的相互作用规律。
8.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，该方法也可以用于研究脂肪酶分布在动物皮内的油脂界面反应性能研究。
9.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，该方法也可以用于研究水相环境中，研究表面活性剂、酸碱度、中性盐、酸、碱、蛋白质、氨基酸、树脂对脂肪酶在油水界面反应性质的影响规律。
...【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，所述方法能直接观察脂肪酶在油水界面的反应性质，包括以下步骤，各操作步骤所用材料除非特别说明均按质量份计：
2.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）可以合并，即可以将油脂、水、脂肪酶一起进行搅拌乳化。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，脂肪酶应该标记物可以是异硫氰酸荧光素、7-氨基-4-甲基香豆素、5-羧基荧光素、二甲氨基萘磺酰氯、四甲基罗丹明 5-甲酰胺-(6-叠氮基己基)、生物素中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究方法，其特征在于，所用脂肪酶是来源于动物、植物、微生物中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪酶在油水界面反应性质的可视化研究...
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