【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为一种用于检测猪圆环4型病毒的引物对及检测方法。
技术介绍
1、猪圆环病毒(porcine circovirus,pcv)为圆环病毒科成员。2019年前，全球范围内仅报道过pcv1、pcv2和pcv3三个基因型。pcv1是1974年从猪肾上皮细胞(pk-15)中分离出来的非致病性病毒粒子。pcv2为引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associated diseases,pcvad)的主要病原，具有较强的致病性，可致宿主机体的免疫抑制，造成免疫功能低下，临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍和呼吸及消化系统疾病。2016年10月，美国堪萨斯州立大学的palinski r等借助宏基因组测序技术从患病母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出pcv3,证实美国多个州猪群存在pcv3感染。随后,波兰、意大利、韩国等国家相继检测出pcv3。虽然目前关于pcv3致病作用的证据较为匮乏,但普遍认为与pdns、繁殖障碍和多系统炎症存在潜在关联。2019年4月,zhang hh等在中国湖南省的几只临床疾病严重的猪身上发现了-种与其他圆环病毒有明显亲缘关系的新型圆环病毒，并命名为pcv4。pcv4与水貂圆环病毒的核苷酸相似性最高(66.9％)，与其它pcv的核苷酸相似性为43.2％-51.5％。猪圆环病毒4型(pcv4)是新发现的圆环病毒科圆环病毒属的成员。自2019年首次在家猪身上发现pcv4以后，国内外开始陆续报道其研究成果。目前，该病毒已在我国和韩国多省的猪群中传播，欧洲、美
技术实现思路
1、(一)技术方案
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于crispr-cas12a检测猪圆环4型病毒的引物、探针及检测方法，包括以下操作步骤：
3、(1)组织样品的处理
4、将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；
5、(2)病毒dna的提取
6、(3)引物设计
7、在genbank中检索多株猪圆环病毒4型全基因组序列，通过meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒4型全基因组中高度保守片段cap基因，使用primer premier 5软件，设计cap基因的全长引物，针对猪圆环病毒4型全基因组中高度保守片段cap基因，使用crispr-dt引物设计软件设计猪圆环病毒4型cap基因的crrna引物和探针，并委托某生物公司合成；
8、根据genbank中检索的多株猪圆环病毒4型参考序列使用primer premier5软件设计全长引物，进行pcr扩增，pcr体系为50μl，其中mix25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，dna模板2μl，灭菌水19μl；
9、(4)pcr产物回收及纯化
10、根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用,置于-20℃保存；
11、(5)标准质粒的构建
12、根据某公司的pmdtm19t vector cloning kit使用说明书，构建pmdtm19t-cap重组质粒；
13、(6)重组质粒鉴定
14、取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与cap基因全长进行比对分析；
15、(7)质粒dna小量抽提
16、根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmdtm19t-cap重组质粒备用；
17、(8)crrna纯化
18、双链dna的合成：将上述合成的crrna单链退火成dna双链，反应体系为50μl，95℃退火5min，自然冷却至室温；
19、转录：将退火得到的双链进行转录，转录试剂购自南京某生物科技股份有限公司，转录体系如下，转录所需dna模板的用量应在0.1～1μg，轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育2h，程序结束后，加入1μl的dnaseⅰ，37℃孵育15min，消化转录的dna模板；
20、crrna纯化；
21、(9)猪圆环病毒4型crispr-cas12a检测体系建立
22、反应时间的优化，反应时间分别设置为5min、10min、15min、20min、25min，30min，35min和40min对pcv4的最佳反应时间进行筛选，并用于后续试验；
23、对设计的三对猪圆环病毒4型crrna引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育30min,在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；
24、灵敏度试验；
25、特异性试验；
26、临床样本检测：根据dna提取方法进行对临床样本进行dna的提取，与era-基础型核酸扩增试剂相结合，使用primer premier 5软件，设计cap基因的era引物，采用本研究建立的crispr cas12a方法对15份样本进行pcv4的检测，同时，使用qpcr技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价crispr技术的临床应用的实用价值；
27、(10)实验结果
28、cap基因重组质粒构建；
29、猪圆环病毒4型的反应时间优化：反应时间分别设置为5min、10min、15min、20min、25min，30min，35min和40min对pcv4的最佳反应时间进行筛选，检测荧光强度，在30min以后趋于稳定，最终选择30min用于后续试验；
30、crrna引物筛选：使用crispr-dt引物设计软件设计猪圆环病毒4型cap基因的crrna引物3条以及一条荧光探针，对设计的三对引物进行筛选，经过筛选第2对引物最优，并用于后续试验；
31、猪圆环病毒4型的灵敏度实验；
32、猪圆环病毒4型的特异性实验；
33、猪圆环病毒4型的临床样本检测。
34、优选的，所述病毒dna的提取包括以下操作步骤：
35、s1、用移液器将20ul proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；
36、s2、向离心管中加入200ul血清；
37、s3、加入200ulcarrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；
38、s4、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；
39、s5、加入500ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测猪圆环4型病毒的ERA引物对，其特征在于，所述ERA引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于检测猪圆环4型病毒的crRNA引物对，其特征在于，所述crRNA引物对为PCV4-crRNA-1、PCV4-crRNA-2、PCV4-crRNA-3中的任意一对；其中，PCV4-crRNA-1的上游引物PCV4-crRNA-F1的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物PCV4-crRNA-R1的序列如SEQ IDNO.4所示；
3.一种用于检测猪圆环4型病毒的混合物，其特征在于，所述混合物由权利要求1所述的ERA引物对和权利要求2所述的crRNA引物对混合组成。
4.如权利要求3所述的混合物，其特征在于，还包括探针，所述探针为FAM-TTTTT-BHQ1。
5.一种猪圆环4型病毒的检测方法，其特征在于，提取待检测样本的DNA，将所述DNA、探针、权利要求1所述的ERA引物对和/或权利要求2所述的crRNA引物对混合反应，通过反应体系的荧光强度确认待检测样本是
6.如权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述探针为FAM-TTTTT-BHQ1。
7.如权利要求5所述检测方法，其特征在于，反应时间为30min。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环4型病毒的era引物对，其特征在于，所述era引物对的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示。
2.一种用于检测猪圆环4型病毒的crrna引物对，其特征在于，所述crrna引物对为pcv4-crrna-1、pcv4-crrna-2、pcv4-crrna-3中的任意一对；其中，pcv4-crrna-1的上游引物pcv4-crrna-f1的序列如seq id no.3所示，下游引物pcv4-crrna-r1的序列如seq idno.4所示；
3.一种用于检测猪圆环4型病毒的混合物，其特征在于，所述混合物由...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵颖，宋祥军，吴昊，刘发全，朱良强，杨侃侃，张吴隐，祁克宗，涂健，刘红梅，王立，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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