【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药理学药剂学领域，具体地，涉及一种靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，以及一种基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法。
技术介绍
1、癌症在2020年导致近1000万人死亡，而众多癌症中，乳腺癌已成为发病率最高的癌症，给公众健康造成了严重的威胁。乳腺癌的现有治疗包括手术、放疗和化疗。早期乳腺癌、局部晚期乳腺癌、局部复发均可治愈。然而，许多患者会有转移、复发和耐药性，因此开发新的靶向药物具有十分重要的意义。
2、五环三萜类化合物白桦脂酸对多种癌症具有抑制作用，但白桦脂酸作为抗癌药物仍有一定的局限性：(1)水溶性差；(2)半衰期短；(3)缺少靶向性；(4)多药耐药性等。这些局限性限制了白桦脂酸作为药物的应用，故开发合适的剂型以克服其局限性，成为目前被着重关注的内容。
3、网络药理学是一种借助于数据库在分子水平上预测药物作用机制的一种方法，通过目标分子所延伸出的分子网络、网络靶点等信息揭示生物系统与药物之间复杂的关系，为生物活性物质的发现、机理研究以及新药的研发等领域提供了新的思路。
4、细胞膜仿生纳米载体依靠细胞膜作为包裹纳米颗粒的外壳，成为一种新型仿生纳米系统。单核巨噬细胞是一种免疫细胞，隐藏在巨噬细胞细胞膜中的纳米载体具有伪装作用，可以逃避免疫监视。此外，单核巨噬细胞在肿瘤微环境中含量丰富，可以表达多种蛋白质，这些蛋白质可与肿瘤细胞表面的粘附分子结合。故可使用巨噬细胞膜为脂质结构包裹药物。
5、细胞-细胞识别介导了大多数调节免疫、
6、核酸适配体是合成的单链核酸链(ssdna或rna)，通过指数富集的配体系统进化(selex)从寡核苷酸库中获得，对金属离子、小分子、蛋白质甚至细胞和组织等多种靶标具有较高的结合亲和力和特异性。syl3c、sgc8c、c-met分别为epcam、ptk-7、met三种蛋白的核酸适配体，可以特异识别这三种蛋白。
7、结合上述技术，可以制备由巨噬细胞膜包裹、修饰核酸适配体的纳米载药系统，用于靶向肿瘤细胞，提高白桦脂酸的生物利用度，并研究该载药系统的作用机制，为日后的新药开发提供理论依据。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统及其制备方法与应用，通过诱导后提取细胞膜，包裹药物连接适配体制备靶向药，随后利用网络药理学并结合体外实验验证白桦脂酸及其靶向药治疗乳腺癌作用机制，将体外药效学的实验结果与网络药理学获得的关键靶点以及相关通路进行对应，确定其潜在的分子机制，为后续的开发应用提供参考。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供一种靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，由包括以下步骤的方法制备得到：
3、(1)巨噬细胞的诱导及细胞膜提取
4、取鼠源巨噬细胞raw264.7，于37℃、5％co2的培养箱中培养；培养基补加10％灭活胎牛血清、100u/ml青霉素以及10mg/l链霉素；细胞贴壁后吸出培养基，用pbs清洗两次，继续培养；当细胞生长至80％-90％用细胞刮刀刮下，传代，每1～2天传代一次；取对数生长期细胞备用；
5、用脂多糖lps诱导巨噬细胞，将m0型巨噬细胞诱导为m1型，检测炎症因子，诱导成功后，提取细胞膜；
6、(2)包裹巨噬细胞膜的白桦脂酸ba@m1的制备
7、将提取的细胞膜按每1×108个细胞的膜与1mg白桦脂酸药物混合，超声混匀后用挤出法制备膜包裹的白桦脂酸ba@m1；
8、(3)连接核酸适配体的复合纳米递送系统ba@ma的制备
9、将适配体sgc8c，c-met，syl3c与ba@m1共孵育，得到连接核酸适配体的复合纳米递送系统ba@ma。
10、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(1)中，用脂多糖lps诱导巨噬细胞的方式包括：用含1μg/ml脂多糖lps的培养基培养巨噬细胞24h，后取细胞上清液，用no试剂盒检测no分泌量；用培养基稀释1m的nano2标准品为100μm、60μm、40μm、20μm、10μm、5μm、2μm、1μm的系列标准品溶液；在96孔板中加入标准品溶液及样品，每孔50μl，再向每孔加入50μl griess试剂ⅰ，后每孔加入50μl griess试剂ⅱ，540nm测定吸光度；
11、采用elisa试剂盒检测炎症因子tnf-α分泌量和il-6分泌量；
12、提取细胞膜的方法包括：用细胞刮刀收集诱导成功的巨噬细胞，细胞计数后，4℃，600g离心5min，去上清液，再4℃，600g，1min进一步去除上清液，每2000万-5000万细胞加入1ml提前2-3min加入pmsf的膜蛋白提取试剂a液，冰上静置12min，后用液氮反复冻融3次，4℃，700g，离心10min，收集上清液，4℃，14000g离心30min，收集细胞膜沉淀。
13、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(2)中ba@m1的制备方法包括：将白桦脂酸标准品溶于少量二甲亚砜中，取1mg白桦脂酸1×108个细胞的膜溶于培养基中混匀，超声30min，后用脂质体挤出器反复挤出10次，得到ba@m1。
14、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(3)中ba@ma的制备方法包括：将单端修饰胆固醇的核酸适配体sgc8c，c-met，syl3c溶于超纯水中，调整浓度为5×105个细胞对应每个适配体的浓度为50nm，将核酸适配体加入ba@m1中，室温孵育15min，得到ba@ma。
15、本专利技术还提供一种基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸靶向药抗乳腺癌作用机制的方法，所述白桦脂酸靶向药为上述的ba@m1或ba@ma；所述方法包括以下步骤：
16、s1、获取白桦脂酸作用靶点
17、从pubchem数据库以betulinic acid为关键词获取白桦脂酸的作用靶点，将白桦脂酸结构的sdf文件导入pharmmappe数据库和swisstargetprediction数据库合并去重得到白桦脂酸相关靶点；
18、s2、疾病作用靶点的识别
19、在genecards数据库中以“breast cancer”为关键词进行乳腺癌相关靶点的寻找，将获得的疾病靶点与s1获得的药物相关靶点进行取交集，所得的交集基因为药物-疾病交集靶基因；
20、s3、构建药物-疾病交集靶基因蛋白互作图，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，由包括以下步骤的方法制备得到：
2.根据权利要求1所述的靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，其特征在于，步骤(1)中，
3.根据权利要求1所述的靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，其特征在于，步骤(2)中BA@M1的制备方法包括：将白桦脂酸标准品溶于少量二甲亚砜中，取1mg白桦脂酸与1×108个细胞的膜溶于培养基中混匀，超声30min，后用脂质体挤出器反复挤出10次，得到BA@M1。
4.根据权利要求1所述的靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，其特征在于，步骤(3)中BA@MA的制备方法包括：将单端修饰胆固醇的核酸适配体Sgc8c，c-Met，SYL3C溶于超纯水中，调整浓度为5×105个细胞对应每个适配体的浓度为50nM，将核酸适配体加入BA@M1中，室温孵育15min，得到BA@MA。
5.一种基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸靶向药抗乳腺癌作用机制的方法，所述白桦脂酸靶向药为权利要求1-4任意一项中所述的BA@M1或BA@MA；所述
6.根据权利要求5所述的基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法，其特征在于，步骤S6中通路的验证主要是经过GO和KEGG富集分析所得到的PI3K/AKT和MAPK信号通路。
7.根据权利要求5所述的基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法，其特征在于，步骤S6中人源乳腺癌MCF-7细胞进行增殖实验步骤包括：将样品BA、BA@M1、BA@MA用培养基稀释成0、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM系列浓度样品，对照组加入相同浓度、体积的五氟尿嘧啶(5-FU)、将S5对数生长的人源乳腺癌MCF-7细胞接种于96孔板，每组五个复孔；培养24小时后将孔内培养基吸出，PBS清洗两次，加等量上述不同浓度的白桦脂酸以及五氟尿嘧啶孵育24以及48小时，到时间后吸出孔板的含药培养基，PBS清洗后每孔加入100μL的普通培养基，再加入10μL的CCK-8溶液放置培养箱中孵育三个小时，将孔板置于酶标仪读取450nm处的吸光度，根据吸光度计算细胞增殖抑制率。
8.根据权利要求5所述的基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法，其特征在于，步骤S6中使用BBcellProbeTMAnnexin V-FITC凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测，细胞培养24h后加入同浓度80μM的含BA、BA@M1、BA@MA和阳性药五氟尿嘧啶的培养基分别处理24h，处理完成后，用不含EDTA的胰酶消化离心后收集细胞，预冷PBS洗涤细胞两次，弃去PBS，用400μL AnnexinV结合液悬浮细胞，浓度为1×106个/ml，加入5μLAnnexinV-FITC染色液，轻轻混匀后于4℃避光染色15min，加入10μL PI染色液后，轻轻混匀于4℃遮光孵育5min，流式细胞仪检测。
9.根据权利要求5所述的基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法，其特征在于，步骤S6中使用线粒体膜电位检测试剂盒加入等量含有不同浓度药物的含药培养基处理48h；使用荧光亲脂阳性探针JC-1，所述荧光亲脂阳性探针JC-1为5,5',6,6'-TETRACHLORO-1,1',3,3'-TETRAETHYL-IMIDACARBOCYANINE IODIDE，遵循线粒体膜电位试剂盒说明书进行处理，荧光显微镜观察荧光变化。
10.根据权利要求5所述的基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法，其特征在于，步骤S6中依据通路图所显示的基因，用总RNA提取试剂盒，从MCF-7细胞中提取总RNA，用反转录试剂盒，RNA在冰上反转录成cDNA，使用定量系统以β-actin作为内源性对照，用作为内源性对照法计算相对倍数变化进行qRT-PCR。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，由包括以下步骤的方法制备得到：
2.根据权利要求1所述的靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，其特征在于，步骤(1)中，
3.根据权利要求1所述的靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，其特征在于，步骤(2)中ba@m1的制备方法包括：将白桦脂酸标准品溶于少量二甲亚砜中，取1mg白桦脂酸与1×108个细胞的膜溶于培养基中混匀，超声30min，后用脂质体挤出器反复挤出10次，得到ba@m1。
4.根据权利要求1所述的靶向乳腺癌的适配体-巨噬细胞膜复合纳米递送系统，其特征在于，步骤(3)中ba@ma的制备方法包括：将单端修饰胆固醇的核酸适配体sgc8c，c-met，syl3c溶于超纯水中，调整浓度为5×105个细胞对应每个适配体的浓度为50nm，将核酸适配体加入ba@m1中，室温孵育15min，得到ba@ma。
5.一种基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸靶向药抗乳腺癌作用机制的方法，所述白桦脂酸靶向药为权利要求1-4任意一项中所述的ba@m1或ba@ma；所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法，其特征在于，步骤s6中通路的验证主要是经过go和kegg富集分析所得到的pi3k/akt和mapk信号通路。
7.根据权利要求5所述的基于网络药理学及体外药效学分析白桦脂酸药物抗乳腺癌作用机制的方法，其特征在于，步骤s6中人源乳腺癌mcf-7细胞进行增殖实验步骤包括：将样品ba、ba@m1、ba@ma用培养基稀释成0、10μm、20μm、40μm、80μm、160μm系列浓度样品，对照组加入相同浓度、体积的五氟尿嘧啶(5-fu)、将s5对数生长的人源乳腺癌mcf-7细胞接种于96孔板，每组五个复孔；培养24小时后将孔内培养基吸出，pbs清洗两次，加等量上述不同浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，蒋玉菡，王宏勋，李龙杰，徐子洋，易阳，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：
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