【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及类固醇激素检测方法，具体涉及一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法以及样品预处理方法。
技术介绍
1、小鼠或者大鼠是常用于药物功效评价、药理作用机制研究、病理研究等的模型动物。研究人员可对不同处理条件下或者不同状态的小鼠、大鼠进行类固醇激素检测，进而反映或者评价药物对于类固醇激素代谢的影响，揭示影响类固醇激素代谢的药理作用机制，探索相关疾病发生发展机理。实现上述目的的前提在于是否能够对小鼠、大鼠生物样本中的多种类固醇激素进行准确定量检测，其中，研究尿液的类固醇激素含量是一个重要方向。目前，针对人类的尿液类固醇激素检测已存在一些研究，然而在实践过程中，专利技术人发现对实验鼠类的尿液采用现有的人尿样本预处理方法，其检测效果存在严重的基质效应干扰。究其原因，实验鼠类于人类为不同生物种属，其尿液的主要组成成分如无机盐、蛋白质、内源性小分子代谢物的种类和浓度具有很大区别，致使尿液的黏度、表面张力、ph值、缓冲能力等特性均具有较大差异。另一方面，实验鼠类的生物行为方式复杂，尿液收集通常在代谢笼中进行，受到粪便、细菌污染的可能性大，使尿液中存在的干扰物更为复杂多样。因此，采用现有的技术对鼠尿进行样本处理，其净化能力有限，基质干扰严重，无法实现对游离类固醇激素，特别是低浓度的激素如醛固酮的准确检测。如何使得鼠尿的基质效应大幅度降低，提升检测目的物质的信号强度，提高检测灵敏度和准确性，提升对不同鼠种的个体差异的容忍度，这是相关科研人员亟需解决的问题。
2、除此之外，以往对动物实验中游离类固醇激素的研究集中在皮质酮、醛固酮等
技术实现思路
1、本专利技术意在提供一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，以解决由于鼠尿成分复杂难以实现包括醛固酮、18-羟基皮质酮和11-脱氧皮质酮在内的多种游离类固醇激素的有效检出的技术问题。
2、为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的；包括以下依次进行的步骤：
4、s1样品预处理步骤：在鼠尿液中加入沉淀剂和内标液，经混合、离心后取上清液，上清液使用去离子水稀释获得待萃取样品；将待萃取样品上样于活化后的固相萃取板上，然后依次使用去离子水、氨水和氨水与甲醇的混合液淋洗，再使用乙酸甲醇混合液洗脱，获得洗脱液；使用洗脱液配制待上样样品；
5、s2检测步骤：使用lc-ms/ms法对待上样样品进行检测。
6、本技术方案还提供了一种用于游离类固醇激素检测的鼠尿样品预处理方法，包括如下依次进行的步骤：
7、ss1沉淀步骤：在鼠尿液中加入沉淀剂和内标液，经混合、离心后取上清液，上清液使用去离子水稀释获得待萃取样品；
8、ss2固相萃取：将待萃取样品上样于活化后的固相萃取板上，然后依次使用去离子水、氨水和氨水与甲醇的混合液淋洗，再使用乙酸甲醇混合液洗脱，获得洗脱液；使用洗脱液配制待上样样品。
9、进一步，所述游离类固醇激素包括皮质酮、18-羟基皮质酮、11-脱氧皮质酮、醛固酮、雄烯二酮、睾酮和孕酮。
10、进一步，在s1中，沉淀剂由体积比为4：1的硫酸锌溶液和甲醇组成；硫酸锌溶液的浓度为0.1m；所述内标液中含有醛固酮-d4、皮质酮-d4、雄烯二酮-d7、睾酮-d5、17-羟基孕酮-d8、孕酮-d9，且浓度分别为1、5、1、1、0.5、0.4ng/ml。
11、进一步，鼠尿液、沉淀剂和内标液的体积比为100：500：20。
12、进一步，在淋洗阶段，氨水的氨的质量百分数为5％；氨水与甲醇的混合液中氨的质量百分数为5％、甲醇的体积百分数为35％。
13、进一步，在淋洗阶段，淋洗用的水、氨水和氨水与甲醇的混合液的用量均为300-500μl/孔。
14、进一步，洗脱用的乙酸甲醇混合液为含有1％乙酸的甲醇；洗脱次数为2次，每次洗脱乙酸与甲醇的混合液的用量为40-60μl/孔；使用洗脱液配制待上样样品的方法为：使用去离子水稀释洗脱液，用量为100-150ul/孔。
15、进一步，使用高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法对待上样样品进行检测时，液相色谱条件为：
16、色谱柱为waters beh c18柱；柱温45℃；进样量20μl；流速0.35ml/min；采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱：流动相a为含有0.15mm氟化铵和5％甲醇的混合水溶液；流动相b为甲醇。
17、进一步，使用lc-ms/ms法对待上样样品进行检测时，质谱条件为：采用电喷雾离子化的多离子反应监测模式；电压为正电压4000v；鞘气45arb；辅助气10arb；离子传输管温度为320℃；蒸发温度为300℃。
18、本技术方案的原理以及有益效果在于：
19、针对鼠尿与人尿样本的区别和特殊性，本技术方案首先使用80％硫酸锌+20％甲醇作为沉淀剂(即沉淀剂为含有0.08m硫酸锌、含有体积百分比为20％的甲醇的水溶液)，除去杂质并减轻基质效应，以及同时保证目的类固醇激素和杂质充分分离以及释放到上清液中，提升目的类固醇激素的检测信号强度。专利技术人经实验研究发现，常用的蛋白质沉淀剂(乙腈、硫酸锌等)虽然具有不同程度的蛋白质沉淀和清除杂质的功能，但是，这些蛋白质沉淀剂会同时对目的类固醇激素产生一定的吸附效应，使得提取获得的目的类固醇激素的量显著下降。虽然甲醇等沉淀剂对类固醇激素的提取量有小幅度的提升效果，但是所带来的增益并不明显。所以，针对鼠尿中的皮质酮、18-羟基皮质酮、11-脱氧皮质酮、醛固酮、雄烯二酮、睾酮和孕酮等类固醇激素，如何有效提取富集，这是尚未有现有技术报道的。专利技术人通过大量的实验探索，发现80％硫酸锌+20％甲醇作为沉淀剂可以有效提升上述多种游离类固醇激素的提取量，使得在后后续lc-ms/ms检测中，这些类固醇激素的信号强度大幅度提升。硫酸锌溶液本身对提升这些目的物质的信号强度具有负面影响，但是，硫酸锌和甲醇结合使用后，产生的效果比单独使用甲醇的效果提升较大，这是专利技术人在实验之前未能预料的。
20、除了萃取前的沉淀处理，萃取过程中的淋洗液和洗脱液的选用，对上述目的类固醇激素的提取量(提取率)以及检测信号强度，均有较为显著的影响。依次使用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的；包括以下依次进行的步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：所述游离类固醇激素包括皮质酮、18-羟基皮质酮、11-脱氧皮质酮、醛固酮、雄烯二酮、睾酮和孕酮。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：在S1中，沉淀剂由体积比为4：1的硫酸锌溶液和甲醇组成；硫酸锌溶液的浓度为0.1M；所述内标液中含有醛固酮-d4、皮质酮-d4、雄烯二酮-d7、睾酮-d5、17-羟基孕酮-d8、孕酮-d9，且浓度分别为1、5、1、1、0.5、0.4ng/mL。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：鼠尿液、沉淀剂和内标液的体积比为100：500：20。
5.载有权利要求4所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：在淋洗阶段，氨水的氨的质量百分数为5％；氨水与甲醇的混合液中氨的质量百分数为5％、甲醇的体积百分数为35％。
6.根据权利要
7.根据权利要求6所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：洗脱用的乙酸甲醇混合液为含有1％乙酸的甲醇；洗脱次数为2次，每次洗脱乙酸与甲醇的混合液的用量为40-60μL/孔；使用洗脱液配制待上样样品的方法为：使用去离子水稀释洗脱液，用量为100-150μL/孔。
8.根据权利要求1述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：使用LC-MS/MS法对待上样样品进行检测时，液相色谱条件为：
9.根据权利要求8所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：使用LC-MS/MS法对待上样样品进行检测时，质谱条件为：采用电喷雾离子化的多离子反应监测模式；电压为正电压4000V；鞘气45Arb；辅助气10Arb；离子传输管温度为320℃；蒸发温度为300℃。
10.一种用于游离类固醇激素检测的鼠尿样品预处理方法，其特征在于：包括如下依次进行的步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的；包括以下依次进行的步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：所述游离类固醇激素包括皮质酮、18-羟基皮质酮、11-脱氧皮质酮、醛固酮、雄烯二酮、睾酮和孕酮。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：在s1中，沉淀剂由体积比为4：1的硫酸锌溶液和甲醇组成；硫酸锌溶液的浓度为0.1m；所述内标液中含有醛固酮-d4、皮质酮-d4、雄烯二酮-d7、睾酮-d5、17-羟基孕酮-d8、孕酮-d9，且浓度分别为1、5、1、1、0.5、0.4ng/ml。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：鼠尿液、沉淀剂和内标液的体积比为100：500：20。
5.载有权利要求4所述的一种用于检测鼠尿游离类固醇激素的方法，其特征在于：在淋洗阶段，氨水的氨的质量百分数为5％；氨水与甲醇的混合液中氨的质量百分数为5％、甲醇的体积百分数为35％。
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【专利技术属性】
技术研发人员：何一帆，杨淑敏，胡金波，李启富，马莉，甄乾娜，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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