【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶活提高的酰基转移酶突变体，属于酶工程。
技术介绍
1、n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸是一种具有广泛应用领域的重要氨基酸衍生物。它在制药工业中具有重要地位，常被用作合成药物和抗生素的中间体。这种化合物不仅在药物合成中有重要作用，还在生物医学研究中备受瞩目。其引人关注的抗氧化和抗炎性活性使其成为疾病治疗和健康维护领域的关键组分。
2、n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸以及其前体反式-4-羟脯氨酸可通过胶原蛋白的化学合成获得。在这一过程中，反式-4-羟脯氨酸作为底物在酸性条件下通过乙酰化反应得到。然而，这种化学合成方法通常需要使用某些毒性试剂，存在安全性方面的顾虑。
3、近年来，采用生物催化法合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸受到了广泛关注，尤其是通过酶的作用，特别是酰基转移酶。酰基转移酶是一类具有酰基转移催化活性的酶，它们能够在底物分子中转移酰基团。在合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的过程中，酰基转移酶发挥关键作用，将乙酰基(acetyl group)转移给4-羟基脯氨酸(4-hydroxyproline)，从而形成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸。
4、尽管生物催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的研究仍处于初级阶段，但这一方法具有巨大的潜力，不仅能够提高合成效率，减少使用有害试剂的需求，还能够改善合成过程的可持续性，为未来的制药工业和医学研究提供了有希望的方向。
5、在现有技术中，使用酰基转移酶合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸仍面临一系列挑战和问题
技术实现思路
1、为了进一步挖掘酰基转移酶的潜力，提高酰基转移酶的酶活，本专利技术提供了一种酰基转移酶突变体，与突变前相比，突变体对于反式-4-羟脯氨酸的转化率提高，进一步提高了n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产量。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种酰基转移酶突变体，所述酰基转移酶突变体在氨基酸序列如seq id no.2所示的酰基转移酶的基础上由第97位、第154位中任一一个或多个位点突变得到。
3、在一种实施方式中，所述第97位的赖氨酸突变为丙氨酸(简称k97a)；
4、在一种实施方式中，所述第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(简称f154a)；
5、在一种实施方式中，在第97位的赖氨酸突变为丙氨酸的基础上进一步将第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(简称k97a/f154a)。
6、本专利技术的第二个目的是提供编码上述酰基转移酶突变体的基因。
7、本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。
8、在一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pet载体。
9、在一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pet-22b。
10、本专利技术还提供携带上述基因或重组质粒的宿主细胞。
11、在一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
12、在一种实施方式中，所述宿主细胞大肠杆菌。
13、在一种实施方法中，宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
14、本专利技术的第三个目的是提供上述酰基转移酶突变体或上述宿主细胞在合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸中的应用。
15、本专利技术还提供上述基因或上述重组质粒在合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸中的应用。
16、本专利技术的第四个目的是提供一种合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的方法，将上述酰基转移酶突变体或上述宿主细胞加入n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸合成体系，体系中含有反式-4-羟脯氨酸、酰基供体。
17、在一种实施方法中，所述酰基供体可以是如下一种或者多种：乙酸乙酯乙酸乙烯酯、乙酸异丙酯、乙酸异丙烯酯、乙酸异戊酯、乙酸对硝基苯酯。
18、在一种实施方法中，所述方法中，还存在表面活性剂。
19、在一种实施方法中，所述表面活性剂可以是如下一种或者多种：dmso、异丙醇、甘油、peg 4000、triton x-100、tween 80。
20、在一种实施方法中，所述基因工程菌是在zybm9培养基中，于37℃，220rpm培养至od600＝0.8-1.0，添加终浓度为400μm的乳糖，于20℃，220rpm诱导培养16h，离心获得全细胞催化剂。
21、在一种实施方法中，所述n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸合成体系中，初始含有反式-4-羟脯氨酸的添加量为5～200g/l，酰基供体0.5～20％v/v，表面活性剂0.5～5％v/v，湿菌体终浓度为0.2～3*1010cfu/ml。
22、在一种实施方法中，所属的全细胞催化是将湿菌体重悬于磷酸缓冲液中，反应体系包含40g/l反式-4-羟脯氨酸，乙酸乙酯10％(v/v)，dmso 0.5-2％(v/v)，湿菌体添加到反应体系中的终浓度为0.2～3*1010cfu/ml。
23、在一种实施方式中，所述反应在25-35℃，180-220rpm条件下进行。
24、有益效果：
25、本专利技术通过对酰基转移酶的不同位点进行点突变，突变后转化率提高24.4％以上，并提高了基因工程菌株催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产量，产量达到0.3125g/l以上。
26、特别的，突变体k97a/f154a的效果最好，以大肠杆菌bl21为宿主，在底物为40g/l的反式-4-羟脯氨酸中，n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产量达到0.4332g/l，较未突变前提高了72.4％。
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1.一种酰基转移酶突变体，其特征在于，所述酰基转移酶突变体在氨基酸序列如SEQID NO.2所示的酰基转移酶的基础上由第97位、第154位中任一一个或多个位点突变得到。
2.根据权利要求1所述的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述第97位的赖氨酸突变为丙氨酸；第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；在第97位的赖氨酸突变为丙氨酸的基础上进一步将第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸。
3.编码权利要求1或2所述酰基转移酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体。
6.携带权利要求3所述基因或权利要求4～5所述重组质粒的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌。
8.权利要求1～2所述酰基转移酶突变体或权利要求6～7所述宿主细胞在合成N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸中的应用。
9.权利要求3所述基因或权利要求4～5所述重组质粒在合成N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸中的应
10.一种合成N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1～2所述酰基转移酶突变体或权利要求6～7所述宿主细胞加入N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸合成体系，体系中含有反式-4-羟脯氨酸、酰基供体。
...【技术特征摘要】
1.一种酰基转移酶突变体，其特征在于，所述酰基转移酶突变体在氨基酸序列如seqid no.2所示的酰基转移酶的基础上由第97位、第154位中任一一个或多个位点突变得到。
2.根据权利要求1所述的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述第97位的赖氨酸突变为丙氨酸；第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；在第97位的赖氨酸突变为丙氨酸的基础上进一步将第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸。
3.编码权利要求1或2所述酰基转移酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pet载体。
6.携带...
【专利技术属性】
技术研发人员：程景方，薛儒康，孙付保，魏川翔，孙驰贺，胡芸，
申请(专利权)人：可莱尼化妆品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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