一种子宫内膜干细胞的培养方法以及培养基技术

技术编号：40460136 阅读：5 留言：0更新日期：2024-02-22 23:15

本发明专利技术公开了一种子宫内膜干细胞的培养方法以及培养基。其培养基包含如下组分：组分1：10％FBS(胎牛血清)的低糖DMEM；组分2：120‑300pmol/L细胞生长因子；组分3：20‑50ng/mL LIF；组分4：5‑10％(V/V)蒲公英外泌体提取物。一方面，本发明专利技术的培养基有利于间充质干细胞的生长，能全方位的补充间充质干细胞生长所需的营养成分，使得间充质干细胞能在体外快速分裂增值；另一方面，本发明专利技术的培养基可以有效避免间充质干细胞在体外培养过程中出现分化，还能使得子宫内膜干细胞这类型较为成熟的间充质干细胞能够保持原有的干性，迅速分裂增值，细胞纯度高，质量均一，数量充足，克服了分化程度较高的间充质干细胞在体外培养易于分化的缺点。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，尤其涉及一种子宫内膜干细胞的培养方法。

技术介绍

1、干细胞是指在一定条件下可以无限自我更新和增殖分化的细胞，包括从胚胎发育到成人生长发育过程中各种未分化的细胞。从受精卵到胚胎发育，直至最终衰老死亡的整个生命过程中都贯穿干细胞的存在、自我更新和发育分化。干细胞研究是近年生命科学领域发展最快、最受重视的前沿生物技术，涉及生命科学和生物医药的所有领域，在细胞治疗、器官移植、基因治疗、新药筛选等方面发挥重要作用。

2、在一个妇女的生育期,子宫内膜历经约400多次再生、分化和剥脱的动态循环过程，每个月经周期中增殖期子宫内膜都会在体内雌激素水平不断增加的作用下在4～10d内增厚4～10mm。分娩后、子宫内膜切除后和绝经后妇女应用激素替代治疗时也会发生内膜再生。prianishnikov于1978年提出子宫内膜干细胞的概念，并认为其可使子宫内膜功能层增生修复，并提示，子宫内膜干细胞位于基底层，并存在上皮和基质两种类型干细胞。

3、子宫内膜干细胞目前主要的分离方法ficoll分离法和细胞自然沉降贴壁法，ficoll从经血中分离出来是单个核细胞，该细胞群含有多种类型的细胞：人外周血的单个核细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、内膜上皮细胞等，因此可以通过ficoll密度梯度离心珐法获取子宫内膜干细胞。采用细胞自然贴壁法，该方法所获得的细胞纯度低，不利于子宫内膜干细胞的后续纯化。此外，现有的宫内膜干细胞分离后即直接接种，这种直接接种的方式会影响子宫内膜干细胞的贴壁；且培养体系均为普通的培养体系，导致子宫内膜

4、综上所述，传统的干细胞培养基不适用于子宫内膜干细胞的培养，传统的干细胞培养基会导致子宫内膜干细胞的增值效率低，细胞质量差；子宫内膜干细胞在有限代增值后，便出现分化；不能满足临床细胞用量需求。

技术实现思路

1、本专利技术一方面的目的是提供一种适用于子宫内膜干细胞规模化培养的培养方法。其包含如下步骤：

2、1)子宫内膜干细胞的获取：在月经周期的最初几天，在月经周期的最初几天使用月经杯采集经血，处理后得到子宫内膜细胞组织；

3、2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1-2mm3碎块，加入消化液于37℃消化处理1-2h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；

4、3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4-5×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养3-8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养7-10天，收取贴壁细胞，并标记为p0代细胞；

5、4)待细胞融合率达85％左右，将p0细胞进行传代培养。

6、本专利技术另一方面的目的是提供一种适用于子宫内膜干细胞规模化培养的培养基。其包含如下组分：组分1：10％fbs(胎牛血清)的低糖dmem；组分2：120-300pmol/l细胞生长因子；组分3：20-50ng/mllif；组分4：5-10％(v/v)蒲公英外泌体提取物。

7、其中所述的细胞生长因子可以为碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子中的一种或多种。

8、在一个优选的实施方案中，细胞因子的浓度可以为130pmol/l、140pmol/l、150pmol/l、160pmol/l、170pmol/l、180pmol/l、190pmol/l、200pmol/l、210pmol/l、220pmol/l、230pmol/l、240pmol/l、250pmol/l、260pmol/l、270pmol/l、280pmol/l、290pmol/l。

9、更优选150pmol/l和200pmol/l。

10、在一个优选的实施方案中lif的浓度可以为25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml。

11、在一个优选的实施方案中lif的浓度可以为31ng/ml、32ng/ml、33ng/ml、34ng/ml。

12、在一个优选的实施方案中，蒲公英外泌体提取物的浓度可以为6％(v/v)、6.5％(v/v)、7％(v/v)、7.5％(v/v)、8％(v/v)、8.5％(v/v)、9％(v/v)、9.5％(v/v)。

13、有益效果：

14、一方面，本专利技术的培养基有利于间充质干细胞的生长，能全方位的补充间充质干细胞生长所需的营养成分，使得间充质干细胞能在体外快速分裂增值；

15、另一方面，本专利技术的培养基可以有效避免间充质干细胞在体外培养过程中出现分化，还能使得子宫内膜干细胞这类型较为成熟的间充质干细胞能够保持原有的干性，迅速分裂增值，细胞纯度高，质量均一，数量充足，克服了分化程度较高的间充质干细胞在体外培养易于分化的缺点。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种子宫内膜干细胞的培养基，其特征在于，其包含蒲公英外泌体提取物。

2.根据权利要求1所述的培养基，其还包含FBS(胎牛血清)的低糖DMEM培养基、细胞生长因子以及LIF。

3.根据权利要求1所述的培养基，其中蒲公英外泌体提取物的含量为5-10％(V/V)。

4.根据权利要求2所述的培养基，其中所述FBS(胎牛血清)的低糖DMEM培养基的浓度为10％。

5.根据权利要求2所述的培养基，其中细胞生长因子可以为碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的培养基，其中所述细胞生长因子以及LIF含量分别为120-300pmol/L和20-50ng/mL。

7.一种子宫内膜干细胞的培养方法，其特征在于，包含如下步骤：

8.根据权利要求7所述的子宫内膜干细胞的培养方法，其中步骤3)中继续培养时间为7-10天。

9.根据权利要求7所述的子宫内膜干细胞的培养方法，其中步骤3)中细胞接种浓度为4-5×104个/mL。