【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物筛选，具体涉及一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法。
技术介绍
1、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,xod)是一种关键的胞质氧化酶，可以氧化次黄嘌呤和黄嘌呤形成尿酸。研究表明，血液中尿酸浓度高与高尿酸血症和痛风密切相关，因此，痛风和高尿酸血症最有效的治疗方法之一是通过抑制xod活性来降低尿酸水平。然而，现有的黄嘌呤氧化酶抑制剂中，别嘌呤醇存在许多副作用，如发烧、肝炎和肾衰竭；非布索坦的副作用虽然较弱，但是长期使用可能会对肾脏和肝脏功能产生负面影响。因此，仍有必要寻找新的高活性、低毒的xod抑制剂。
2、目前，针对xod抑制剂的筛选方法有uv-vis光谱法、荧光传感器和电化学传感器。尿酸是次黄嘌呤和黄嘌呤通过xod氧化的产物，可以在295nm处通过紫外-可见光谱进行测定。因此紫外-可见光谱法可用于xod活性的测定和抑制剂的筛选。然而，因为许多潜在的抑制剂与尿酸具有相似的吸收光谱，可能会对筛选结果造成干扰，同样，一些具有荧光或氧化还原特性的潜在抑制剂会干扰荧光和电化学筛选方法的结果。上述方法无法在复杂体系(如天然药物提取物)筛选活性化合物。
3、薄层色谱生物自显影法是将薄层色谱分离和生物活性测定相结合进而对天然产物中的复杂成分进行快速活性测定的新方法，可以实现对活性化合物的快速筛选。该方法的反应机理为黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的过程中产生o2·-，o2·-和nbt反应生成紫色的甲瓒，具有抑制黄嘌呤氧化酶或清除o2·-活性的化合物则会表现为紫色背景下的白色斑点。但是该体系在筛选
4、因此，开发一种高效、精确的xod抑制剂的筛选方法具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，该方法能够高效且精确的实现黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：
3、一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
4、(1)将黄嘌呤氧化酶进行固定化处理，得到固定化酶，备用；
5、(2)取所述固定化酶放入微型装载装置，去除溶剂后，加入供试样品溶液和黄嘌呤溶液，在室温下反应30～40min，用移液管加压将底物和介质分离，终止催化反应，取样后采用过氧化氢试纸条进行检测，根据过氧化氢试纸条的显色反应筛选出含有潜在活性成分的样品；
6、(3)取所述固定化酶放入微型装载装置，去除溶剂后，加入步骤(2)筛选的所述含有潜在活性成分的样品，静置30～40min后，洗脱收集样品溶液，采用亲和色谱法进行分离，筛选出黄嘌呤氧化酶抑制剂。
7、优选的，步骤(2)中，所述固定化处理步骤为：将羧基功能化的mwcnt s采用edc和nhs溶液活化0.5-4h，然后加入黄嘌呤氧化酶，将混合物置于振荡器中震荡1-4h，使黄嘌呤氧化酶固定在mwcnts表面，通过过滤分离复合混合物，用tris-hcl缓冲液(0.01m，ph 8.0)洗涤三次后，得到所述固定化酶(xod@mwcnts)。
8、优选的，步骤(2)中，所述固定化酶、供试样品溶液、黄嘌呤溶液体积比为3-6：2-6：2-6。
9、优选的，所述黄嘌呤溶液浓度为200-600μg/ml。
10、优选的，步骤(3)中，所述固定化酶、含有潜在活性成分的样品的体积比为1-4：1-3。
11、优选的，所述微型装载装置由移液管和挡板组成，挡板放置在移液管的底部出口处。
12、优选的，所述亲和色谱法具体为：采用hplc-ms对收集的洗脱液进行进一步分析及结构鉴定，hplc条件为：色谱柱：shim-pack gis c18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：0.1％甲酸:甲醇-20:80，柱温：35℃，流速：0.5ml/min。
13、由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，相比现有技术其有益效果是：本专利技术首先将黄嘌呤氧化酶进行固定化处理得到固定化酶，然后将固定化酶和黄嘌呤放置在微型装载装置中，以催化黄嘌呤的氧化反应，产生h2o2，通过过氧化氢测试条检测收集的流出物中原位形成的h2o2，由于在抑制剂筛选过程中，潜在的抑制剂可以抑制酶的活性，因此原位形成的h2o2减少，从而减少过氧化氢试纸条的颜色变化，进而初步筛选出供试样品中含有潜在活性成分的样品，最后以固定化酶作为亲和层析鉴定介质，采用亲和色谱法对筛选出的含有潜在活性成分的样品进行分离，从而成功筛选出黄嘌呤氧化酶抑制剂。该方法能够高效且精确的实现黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，筛选效率高且假阳性率低。
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1.一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中，所述固定化处理步骤为：将羧基功能化的MWCNTs采用EDC和NHS溶液活化0.5-4h，然后加入黄嘌呤氧化酶，将混合物置于振荡器中震荡1-4h，使黄嘌呤氧化酶固定在MWCNTs表面，通过过滤分离复合混合物，用Tris-HCl缓冲液(0.01M，pH 8.0)洗涤三次后，得到所述固定化酶(XOD@MWCNTs)。
3.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中，所述固定化酶、供试样品溶液、黄嘌呤溶液体积比为3-6：2-6：2-6。
4.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所述黄嘌呤溶液浓度为200-600μg/mL。
5.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：步骤(3)中，所述固定化酶、含有潜在活性成分的样品的体积比为1-4：1-3。
6.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所述微型
7.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所述亲和色谱法具体为：采用HPLC-MS对收集的洗脱液进行进一步分析及结构鉴定，HPLC条件为：色谱柱：Shim-pack GIS C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：0.1％甲酸:甲醇-20:80，柱温：35℃，流速：0.5mL/min。
...【技术特征摘要】
1.一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中，所述固定化处理步骤为：将羧基功能化的mwcnts采用edc和nhs溶液活化0.5-4h，然后加入黄嘌呤氧化酶，将混合物置于振荡器中震荡1-4h，使黄嘌呤氧化酶固定在mwcnts表面，通过过滤分离复合混合物，用tris-hcl缓冲液(0.01m，ph 8.0)洗涤三次后，得到所述固定化酶(xod@mwcnts)。
3.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：步骤(2)中，所述固定化酶、供试样品溶液、黄嘌呤溶液体积比为3-6：2-6：2-6。
4.如权利要求1所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国宁，王晓菲，刘克帅，张淑贤，范晓萱，白长财，郭晓丽，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：
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