【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种肝素结合蛋白的适配体及其应用。
技术介绍
1、肝素结合蛋白(hbp)是一种由中性粒细胞释放的多功能的阳离子抗菌蛋白，可从迁移的多形核白细胞中迅速动员。hbp具有一定的抗菌活性及趋化特性，作为化学引诱剂，是单核细胞和巨噬细胞的激活剂，并诱导血管渗漏和水肿形成。hbp的释放是由趋化因子白介素-8(il-8)与中性粒细胞β2-整合素的连接触发。已经表明，患有严重脓毒症的患者会在血浆中表达高水平的hbp。根据相关文献表明，hbp在血管渗漏、急性胰腺炎症、尿路感染、急性呼吸窘迫症、颅内感染及脑膜炎等都是重要的生物标志物。此外，有研究表明，机体在严重细菌感染如脓毒血症时hbp通过增强内皮通透性可诱导急性肺损伤。综上，蛋白质与严重细菌感染的病理生理学密切相关，可以作为潜在的诊断标志物和治疗靶点。
2、基于酶联免疫吸附试验对血液或体液中hbp的检测，已成为国际上应用最广泛的早期感染标志物的检测方法，但是由于检测时间长、需要专业的检验师进行操作，试剂制备复杂等原因，而无法广泛应用于临床。现今进行适配体筛选的主要技术有：磁珠筛选(mb-selex)、石墨烯筛选(go-selex)、毛细管筛选(ce-selex)、细胞筛选(cell-selex)、微流控筛选等。
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种肝素结合蛋白的适配体、筛选方法，其与肝素结合蛋白具有极强的亲和力和特异性，可用于高效的检测肝素
3、相应地，本专利技术还提供一种肝素结合蛋白的适配体的筛选方法。
4、相应地，本专利技术还提供一种肝素结合蛋白的适配体作为检测肝素结合蛋白探针、适配体在酶联免疫检测方法以及相应检测试剂盒中的肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用。
5、(二)技术方案
6、为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
7、第一方面，本专利技术提供一种肝素结合蛋白的适配体，其核苷酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3中的至少一种所示，所示核苷酸序列中，方向均为5’-3’。
8、第二方面，本专利技术提供上述肝素结合蛋白的适配体的筛选方法，其包括以下步骤：
9、s1设计上游引物、下游引物，合成相应的随机文库；
10、s2反靶蛋白与羧基磁珠孵育偶联制得反筛磁珠；
11、靶蛋白与羧基磁珠孵育偶联制得正筛磁珠；
12、s3以随机文库作为初始文库，进行6～20轮的筛选获得所述核酸适配体；
13、第一轮以初始文库仅进行正筛磁珠的正筛；
14、第二轮以上的筛选均以前一轮筛选后的文库经处理使双链dna变性成单链dna后，再依次进行反筛磁珠的反筛和正筛磁珠的正筛。
15、第三方面，本专利技术还提供上述任一方案中所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用。其中，相应检测产品可以但不仅限于检测试剂盒、检测试剂。
16、可选地，在应用的技术方案中，将所述探针制成检测肝素结合蛋白的探针。
17、可选地，在应用的技术方案中，所述探针为所述适配体修饰巯基后，组装在纳米金表面上形成。
18、可选地，探针组装的方法为：将修饰有巯基的适配体与纳米金溶液混合，加入柠檬酸三钠反应后调节ph值为3，并且在低温下离心取沉淀，得到所述探针。
19、可选地，探针的表征方法包括：将适配体溶解在1×te缓冲液(ph7.8-8.2)中，使用分光光度计测定吸光值。
20、可选地，检测方法为酶联免疫检测法，所述相应检测产品为酶联免疫试剂盒。
21、酶联免疫具体的检测方法可以为：
22、s1肝素结合蛋白抗体作为固定相包被：将肝素结合蛋白抗体稀释到1μg/ml，以100μl/孔，包被于96孔酶标板中，4℃过夜；拍干板孔中的液体，封闭液(含1％bsa的0.01m tbs(8.5)，150μl/孔，室温封闭4小时；弃去孔内液体，甩干；
23、s2加样反应：设待测样品孔7个，依次加入100ul不同浓度的待测样品(10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.312ng/ml、0.156ng/ml)。酶标板覆膜，37℃孵育1小时(设置两个复孔和空白对照，空白孔加100ul超纯水)；弃去孔内液体，甩干；
24、s3加入经过热激活处理(95℃10min，4℃10min，25℃10min)生物素化的肝素结合蛋白(hbp)适配体100μl，酶标板覆膜，37℃孵育1小时，用磷酸盐缓冲液(ph7.4)洗涤3次，甩干：
25、s4每孔加100ul按照1∶100用磷酸盐缓冲液稀释(ph7.4)的hrp标记的链霉亲和素，酶标板覆膜，37℃温育30分钟；弃去孔内液体，洗板5次，甩干；
26、s5每孔加tmb底物溶液100ul，酶标板覆膜。37℃避光显色15分钟。s6每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色(tmb+)立即转黄色(tmb2+)s7立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(o.d值)。
27、酶联免疫试剂盒可以是包括96孔酶联板、hbp标准品、样品稀释液、生物素化的肝素结合蛋白(hbp)适配体、链霉亲和素标记的hrp、tmb底物溶液、洗涤液和终止液。
28、(三)有益效果
29、本专利技术提供的肝素结合蛋白适配体，其弥补了肝素结合蛋白适配体领域的空白，其对hbp蛋白家族良好的亲和力，可特异性结合，对其它蛋白无结合；其可在检测肝素结合蛋白的方法或相应的试剂盒中应用，具体的可与hbp蛋白家族制成分子探针、作为检测试剂等用于hbp蛋白的检测、分离纯化及人感染的早期诊断，提高检测的准确率。
30、其中，本专利技术提供的肝素结合蛋白适配体，可人工合成，成本低、生产周期短，易于化学修饰；
31、本专利技术提供的筛选方法其方法简便，筛选的文库具有较高的保留率。
32、本专利技术所提供的肝素结合蛋白适配体用于检测hbp蛋白具有很高的灵敏度和准确率。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种肝素结合蛋白的适配体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3中的至少一种所示。
2.一种如权利要求1所述肝素结合蛋白的适配体的筛选方法，其特征在于，其包括以下步骤：
3.一种如权利要求1所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用。
4.如权利要求3所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用，其特征在于：将所述适配体制成检测肝素结合蛋白的探针。
5.如权利要求4所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用，其特征在于：所述探针为所述适配体修饰巯基后，组装在纳米金表面上形成。
6.如权利要求5所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用，其特征在于，所述组装的方法为：将修饰有巯基的适配体与纳米金溶液混合，加入柠檬酸三钠反应后调节pH值为3，并且在低温下离心取沉淀，得到所述探针。
7.如权利要求4所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用，所述探针的表征方法包括：将所述探针溶解在1×TE缓冲液中，
8.如权利要求3所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用，其特征在于：所述检测方法为酶联免疫检测法，所述相应检测产品为酶联免疫试剂盒。
...【技术特征摘要】
1.一种肝素结合蛋白的适配体，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1、seq idno.2、seq id no.3中的至少一种所示。
2.一种如权利要求1所述肝素结合蛋白的适配体的筛选方法，其特征在于，其包括以下步骤：
3.一种如权利要求1所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用。
4.如权利要求3所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用，其特征在于：将所述适配体制成检测肝素结合蛋白的探针。
5.如权利要求4所述适配体在肝素结合蛋白检测方法和相应检测产品中的应用，其特征在于：所述探针为所述适配体修饰巯基后，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张胜行，周曦，
申请(专利权)人：中国人民解放军联勤保障部队第九零零医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。