【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血浆蛋白质组学，具体涉及一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法。
技术介绍
1、药物的血浆蛋白结合率是药动学的重要参数之一，药物与血浆蛋白的结合程度直接影响游离型药物的浓度，从而影响药物在体内的分布、代谢和排泄等过程，而且它与药物的药效学及毒理学密切相关，因此检测药物的血浆蛋白结合率对指导临床用药具有重要意义。伏立康唑(vorieonazole，vrc)是第二代三唑类抗真菌药，抗菌谱广、半衰期长、能广泛渗透到体液组织器官，抗菌谱广，对念珠菌属，包括对氟康唑耐药的克柔念珠菌、光滑念珠菌和白色念珠菌有抗菌作用，对所有曲霉属真菌有杀菌作用，此外，对现有抗真菌药敏感性较低的足放线菌属和镰刀菌属也有活性，临床上用于治疗侵袭性曲霉病、氟康唑耐药念珠菌所致的严重侵袭性感染、足放线菌属和镰刀菌属所致的严重感染，已成为侵袭性真菌感染治疗的一线用药。
2、近年来，已有大量关于导致伏立康唑血药浓度个体差异原因的研究，2013年发表在《antimicrobialagents and chemotherapy》上的一项观察性研究(hoenigl m，duettmann w,《raggam rb,et al.potential factors for inadequate voriconazoleplasma concentrations in intensive care unit patients and patients withhematological malignancies》，收集了62例重症患者的221
3、伏立康唑具有非线性代谢动力学特征，药时曲线下面积增加的比例远大于剂量增加的比例，目前，导致伏立康唑非线性动力学的原因并不明确。伏立康唑经肝细胞p450酶系代谢，主要包括cyp2c19、cyp3a4和cyp2c9，已有大量研究表明cyp2c19基因多态性、性别、年龄等因素会显著影响伏立康唑的血药浓度，过低的血药浓度导致治疗失败，过高的血药浓度则会导致不良反应的发生。而已有研究中，上述因素对最终临床疗效的影响却不尽一致。所以，进一步研究影响伏立康唑的药代动力学特征，建立稳定有效的方法检测药代动力学指标，指导临床用药尤为必要。
4、由于大多数药物经各种途径吸收入血后，大多以蛋白结合型和游离型两种状态存在，结合型的药物处存状态不发挥药理作用，只有游离型的药物发挥药理作用，所以，药物的血浆蛋白结合率对于药物疗效的发挥有很大影响。
5、目前所采用的检测血浆蛋白结合率的方法，利用超速离心法将血浆蛋白分离，检测超滤液中游离药物浓度，再将全血浆进行药物萃取，检测全血浆药物浓度，二者差值是蛋白结合药物浓度，蛋白结合率＝(全血浆压药物浓度-游离药物浓度)/全血浆药物浓度×100％。这个方法中，对血浆进行药物萃取的步骤非常关键。结合药物跟蛋白的解离程度就会成为影响蛋白结合率的检测结果。实验结果表明，直接对血浆进行萃取对药物的回收率有很大影响，这也直接影响蛋白结合率的测定。实验过程中发现，磷脂酸与血浆蛋白(特别使白蛋白)的结合远高于伏立康唑，因此如果能够在萃取前采用磷脂酸对血浆样品进行前处理，将促进伏立康唑和血浆蛋白的解离，使检测数据更接近真实。
6、针对以上问题，亟需设计一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，以促进伏立康唑和血浆蛋白的解离，从而解决上述现有技术存在的问题。
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，本方法在萃取前采用磷脂酸对血浆样品进行前处理，有效促进伏立康唑和血浆蛋白的解离，检测的蛋白结合率更接近真实值，对指导临床用药意义重大。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，包括步骤step1.在待测血浆中加入等体积的磷脂酸溶液；
4、step2.将含有磷脂酸的待测血浆在36.5℃—37.5℃水浴中恒温孵育18-24min；
5、step3.再将孵育好的血浆置于0℃—4℃冷藏60min；
6、所述的磷脂酸溶液为用乙酸乙酯：正己烷＝4：1溶解磷脂酸，浓度为1.0—1.2mg/ml。
7、进一步的，所述的含有磷脂酸的待测血浆的孵化时间为20min。
8、进一步的，所述的含有磷脂酸的待测血浆的孵化温度37℃水浴恒温。
9、进一步的，所述的磷脂酸溶液的分子量为510，纯度为99％，浓度为1.2mg/ml。
10、进一步的，所述的待测血浆为伏立康唑血浆蛋白体外结合模型。
11、进一步的，所述的伏立康唑血浆蛋白体外结合模型的制备方法包括：
12、步骤1：配制伏立康唑储备液
13、称量伏立康唑，用乙腈:水＝1：1液体稀释，精确配制成含伏立康唑500μg/ml的溶液，作为储备液；
14、步骤2：体外结合
15、取人血浆490μl，加入10μl储备液，设置37℃恒温摇床上，以50转/min的摇速进行体外结合，结合时间30min，得到伏立康唑血浆蛋白体外结合模型。
16、进一步的，所述方法还包括步骤
17、4)对处理完成后的血浆的检测
18、将样品置centrifree系列超滤离心管中，以1500×g的离心力超滤30min，滤液氮气吹干加入乙腈:水＝1：1的流动相500μl复溶作为待测样品，采用hplc-uv方法检测。
19、进一步的，所述的hplc-uv方法检测过程的色谱条件为：
20、以乙腈:水＝1：1为流动相，设置30℃柱温，伏立康唑和内标物的保留时间均值15min以内，两峰理论塔板数大于5000。
21、本专利技术的有益效果是：本专利技术公开了一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，与现有技术相比，本专利技术的改进之处在于：
22、本专利技术设计了一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，包括步骤step1.在待测血浆中加入等体积的磷脂酸溶液；step2.将含有磷脂酸的待测血浆在36.5℃—37.5℃水浴中恒温孵育18-24min；step3.再将孵育好的血浆置于0℃—4℃冷藏60min；在使用时，本方法通过在萃取前采用磷脂酸对血浆样品进行前处理，实验证明，本方法能够有效促进伏立康唑和血浆蛋白的解离，使得检测的蛋白结合率更接近真实值，对指导临床用药意义重大。
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1.一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：包括步骤
2.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的含有磷脂酸的待测血浆的孵化时间为20min。
3.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的含有磷脂酸的待测血浆的孵化温度37℃水浴恒温。
4.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的孵育好的血浆在60min下的冷藏温度为2℃。
5.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的磷脂酸溶液的分子量为510，纯度为99％，浓度为1.2mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的待测血浆为伏立康唑血浆蛋白体外结合模型。
7.根据权利要求6所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的伏立康唑血浆蛋白体外结合模型的
8.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述方法还包括步骤
9.根据权利要求8所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的HPLC-UV方法检测过程的色谱条件为：以乙腈:水＝1：1为流动相，设置30℃柱温，伏立康唑和内标物的保留时间均值15min以内，两峰理论塔板数大于5000。
...【技术特征摘要】
1.一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：包括步骤
2.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的含有磷脂酸的待测血浆的孵化时间为20min。
3.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的含有磷脂酸的待测血浆的孵化温度37℃水浴恒温。
4.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的孵育好的血浆在60min下的冷藏温度为2℃。
5.根据权利要求1所述的一种检测伏立康唑血浆蛋白结合率时的血浆样品处理方法，其特征在于：所述的磷脂酸溶液的分子量为510，纯度为99％，浓度为1.2m...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘韵，徐恒宇，鲁美丽，王洪新，
申请(专利权)人：沈阳和合医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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