【技术实现步骤摘要】
本专利技术蓝耳病毒检测领域，特别涉及一种适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒及应用。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征(prrs)的病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus,prrsv)，故猪蓝耳症是由prrsv引起的一种以猪繁殖障碍和呼吸困难为主要症状的传染性疾病，以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及猪的呼吸系统疾病和高死亡率为主要特征，该病危害严重，并且目前缺少有效的防治措施。
2、prrsv属于正链rna病毒，属动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，病毒粒子呈卵圆形，外部具有囊膜，囊膜上的衣壳蛋白20面体对称。prrsv没有血凝素蛋白(hemagglutinin，hla)，因此不具有血凝素活性。prrsv基因组大概有15kb，至少有八个orf:orf1a、orf1b和orfs2 -7，orf1a和orf1b编码多聚蛋白，可以制解成非结构蛋白(nsps):nsplα，nsp1β和nsp2-12，orfs2-7编码结构蛋白gp2、gp3 -5、m和n。蓝耳病毒有不同的亚型和血清型，其中最常见的分为1型和2型，蓝耳病毒1型(prrsv-1)：这是最早被发现的蓝耳病毒类型之一，它也被称为欧洲型(european type)或经典型(classical type)。蓝耳病毒1型感染的猪通常表现出较轻的临床症状，但仍然可能导致生殖和呼吸系统问题，影响猪的生产效益，这一型蓝耳病毒在欧洲和其他地区广泛传播；蓝耳病毒2型(p
3、蓝耳病毒对猪产业造成了重大经济损失，因为它会导致生产效益下降、生猪死亡率增加，同时也会增加兽医和治疗成本，目前对于蓝耳病毒的研究主要有以下几种方法：
4、1、血清学诊断方法:
5、常用的血清学方法有血清中和试验、ifa试验、酶联免疫吸附试验等血清学诊断，但迄今为止，尚无任何一种血清学方法能检测所有的prrsv病毒株；
6、2、rt-pcr或荧光rt-pcr方法：
7、现有检测样本中prrsv有无的方法主要是基于qpcr的方法，而目前qpcr方法只检测一个基因位点，存在由于病毒在引物区域的变异或降解而导致假阴性的检测结果和不能获得序列变异信息的局限性；
8、3、测序技术：
9、现用检测序列变异的技术是基于pcr结合一代测序检测1到2个基因区域的变异信息，存在低效、监测范围有限的局限。因此为了获取更全面的序列变异，典型的方法是将整个基因组分为多段，比如14或15段，采用重叠的引物进行pcr扩增和产物的一代测序，然后基于测序结果进行基因组的组装，但是这种方法依赖于病毒的分离培养，而病毒的分离培养比较困难；即使培养成功，由于病毒的高变异性，采用已有引物也很难将全部片段扩增成功，存在灵敏度低、效率低和耗时的局限。
10、因此，急需一种无需培养即可实现高灵敏度的蓝耳病毒1型和2型的全基因检测和变异监测的方案。
技术实现思路
1、本方案提供了一种适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒及应用，能从肺组织、血液、唾液、病毒液等环境中提取的核酸样本中进行蓝耳病毒1亚型和2亚型全基因组反转录与富集扩增，可以用于检测与鉴定蓝耳病毒，也可为蓝耳病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段。
2、本方案提供的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒不仅可用于蓝耳病毒1型和2型全基因组的扩增与测序，而且还可用于蓝耳病毒1型和2型的快速检测与鉴定，不仅适用于近几年流行毒株，而且还适用于回溯性队列研究，具有操作简便、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点，同时也为蓝耳病毒1型和2型病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段。
3、为实现以上专利技术目的，本方案提供了一种适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，包括：四组引物池，其中第一引物池内的引物含有引物序列如seq id no.1-seqid no.22所示的靶向引物；第二引物池内的引物含有引物序列如seq id no 23-seq idno.41所示的靶向引物，第三引物池内的引物含有引物序列如seq id no 42-seq id no.63所示的靶向引物，第四引物池内的引物含有引物序列如seq id no.64-seq id no.82所示的靶向引物。
4、具体的，第一引物池内的靶向引物的引物序列如下表一所示：
5、表一第一引物池的靶向引物
6、
7、
8、其中第一引物池中的seq id no.1-seq id no.22所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对，seq id no.1，seq idno.3，seq id no.5，seq id no.7，seq id no.9，seq id no.11，seq id no.13，seq idno.15，seq id no.17，seq id no.19和seq id no.21对应的是正向的靶向引物，seq idno.2，seq id no.4，seq id no.6，seq id no.8，seq id no.10，seq id no.12，seq idno.14，seq id no.16，seq id no.18，seq id no.20和seq id no.22对应的是反向的靶向引物。
9、具体的，第二引物池内的的靶向引物的引物序列如下表二所示：
10、表二第二引物池的靶向引物
11、
12、
13、其中第二引物池中的seq id no.23-seq id no.41所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对，seq id no.23，seq idno.25，seq id no.27，seq id no.29，seq id no.31，seq id no.33，seq id no.35，seq idno.37，seq id no.39和seq id no.41对应的是正向的靶向引物，seq id no.24，seq idno.26，seq id no.28，seq id no.30，seq id no.32，seq id no.34，seq id no.36，seq idno.38和seq id no.40对应的是反向的靶向引物。
14、具体的，第三引物池内的靶向引物的引物序列如下表三所示：
15、表三第三引物池的靶向引物
16、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，包括：第一引物池和第二引物池内的引物对蓝耳病毒2型进行扩增，第三引物池和第四引物池内的引物对蓝耳病毒1型进行扩增。
3.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，四组引物池中的每一引物由如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.82其中的靶向引物、UMI序列和barcdoe序列排列组成。
4.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，第一引物池中的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对，第二引物池中的SEQ ID NO.23-SEQID NO.41所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对，第三引物池中的SEQ ID NO.42-SEQ ID NO.63所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引
5.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，四组引物池内的引物分别对蓝耳病毒1型和2型进行多重PCR扩增，且四组引物池的多重PCR扩增条件相同。
6.根据权利要求5所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增条件如下表所示：
7.一种适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕捉试剂盒的应用方法，其特征在于，包括：获取待测的蓝耳病毒的逆转录cDNA链，分别利用第一引物池、第二引物池、第三引物池以及第四引物池中的引物对蓝耳病毒的逆转录cDNA链进行扩增得到扩增产物，将扩增产物拼接后利用测序平台测序得到蓝耳病毒1型和2型的全基因序列，其中第一引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示的靶向引物；第二引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO 23-SEQ ID NO.41所示的靶向引物，第三引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO 42-SEQ ID NO.63所示的靶向引物，第四引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO.64-SEQ ID NO.82所示的靶向引物。
8.根据权利要求7所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕捉试剂盒的应用方法，其特征在于，包括：分别利用第一引物池、第二引物池、第三引物池以及第四引物池中的引物对蓝耳病毒的逆转录cDNA链进行多重PCR扩增，多重PCR扩增条件如下表所示：
9.根据权利要求7所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕捉试剂盒的应用方法，其特征在于，利用二代测序平台和三代测序平台对扩增产物进行测序。
10.根据权利要求7所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕捉试剂盒的应用方法，其特征在于，自肺组织、血液、唾液、病毒液等环境中提取的核酸样本中进行蓝耳病毒1亚型和2亚型全基因组反转录与富集扩增。
...【技术特征摘要】
1.一种适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，包括：第一引物池和第二引物池内的引物对蓝耳病毒2型进行扩增，第三引物池和第四引物池内的引物对蓝耳病毒1型进行扩增。
3.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，四组引物池中的每一引物由如seq id no.1-seq id no.82其中的靶向引物、umi序列和barcdoe序列排列组成。
4.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，第一引物池中的seq id no.1-seq id no.22所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对，第二引物池中的seq id no.23-seqid no.41所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对，第三引物池中的seq id no.42-seq id no.63所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对，第四引物池中的seqidno.64-seq id no.82所示的靶向引物中相邻序号的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序两两组成一个引物对。
5.根据权利要求1所述的适用于蓝耳病毒1型和2型的全基因组捕获试剂盒，其特征在于，四组引物池内的引物分别对蓝耳病毒1型和2型进行多重pcr扩增，且四组引物池的多重pcr扩增条件相同。
6.根据权利要求5所述的适用...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓峰，吴斯豪，唐旖，王敏，
申请(专利权)人：杭州柏炬科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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