【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物分子育种，具体涉及一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法。
技术介绍
1、棉花是一种重要的经济作物，棉花产业也是我国国民经济的重要支柱产业。植物中的原生质体是通过物理或者化学方法除去细胞壁后的植物细胞，由于细胞膜具有亲和性，原生质体可用于细胞融合杂交、瞬时转化、亚细胞定位、蛋白互作、代谢网络研究、再生成愈伤组织或胚状体等领域研究。近些年来，随着棉花各品种基因组序列的陆续发表，大量的棉花功能基因亟待验证。因此，利用基于原生质体的基因瞬时表达体系将加速基因功能鉴定的进程，且有助于快速筛选目标性状的dna片段。
2、目前植物原生质体分离的方法主要有机械法和酶解法，但是机械法分离操作困难、得率低，所以主流方法还是可快速分离出大批量、高活性原生质体的酶解法。瞬时转化技术通过将连接目的基因的质粒转染至特定物种原生质体中，使得细胞内游离的载体可在短时间内转录翻译表达出目标蛋白，其短期内快速表达的优点使得其已在转基因检测、细胞定位、生物制剂合成、蛋白互作分析、植物品种选育等许多领域都有大量应用。然而在棉花领域，由于棉花的细胞质次生代谢物众多，富含棉酚、多糖、丹宁等物质，对原生质体提取带来难度，并且各品种间个体、个体内不同器官的渗透压、代谢物都不相同，导致提取的原生质体活力不稳定以及瞬时转化效率低下，并且，由于制备的原生质体的缺陷，会进一步导致利用原生质体真叶转化体系进行转化时耗时长，基本需要耗费两天左右，再加上前期棉花真叶种植需要一月左右，过长的实验时间无法适应高通量高效率的实验需求，如何实现棉花原生质体快速
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种棉花原生质体的制备方法及其应用和转化方法，快速提取高通量、高活力(90％以上)的棉花原生质体，提高棉花原生质体的高效转化。
2、本专利技术提供了一种棉花原生质体的制备方法，包括：将棉花材料和酶解液混合，真空渗透后酶解；对所得酶解料液进行分离，得到所述棉花原生质体；
3、所述棉花材料包括棉花黄化苗子叶或棉花黄化苗愈伤组织；
4、所述酶解液包括：mes 0.02mol/l，纤维素酶15g/l，离析酶4g/l，甘露醇0.4～0.5mol/l，kcl 0.02mol/l，cacl20.01mol/l和bsa 10g/l。
5、优选的，所述棉花黄化苗子叶为严格避光、生长至两片子叶刚刚分离的状态。
6、优选的，当棉花材料为棉花黄化苗子叶时，所述酶解液包括：mes 0.02mol/l，纤维素酶15g/l，离析酶4g/l，甘露醇0.5mol/l，kcl 0.02mol/l，cacl20.01mol/l和bsa 10g/l；当棉花材料为棉花黄化苗愈伤组织时，所述酶解液包括：mes 0.02mol/l，纤维素酶15g/l，离析酶4g/l，甘露醇0.4mol/l，kcl 0.02mol/l，cacl20.01mol/l和bsa 10g/l。
7、优选的，所述酶解液与棉花材料的用量比为10ml：0.3～1g；所述酶解的转速为55rpm，时间为4～5h，温度为20～28℃。
8、优选的，所述真空渗透的条件为避光，压强0.06～0.08mpa，时间为30min；所述分离的方式包括用孔径大小为40μm的细胞筛进行过筛分离。
9、本专利技术还提供了上述技术方案所述的制备方法在原生质体瞬时转化中的应用。
10、本专利技术还提供了一种棉花原生质体的转化方法，包括以下步骤：
11、利用上述技术方案所述的制备方法制备棉花原生质体，利用w5溶液洗涤后利用mmg溶液重悬，得到棉花原生质体悬浮液；
12、将所述原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒和转化缓冲液混匀，避光转化，然后加入w5，离心，去除上清后，用wi溶液重悬，得到转化后的原生质体悬浮液；
13、对转化后的原生质体悬浮液于28℃避光培养4.5h～5h，得到高通量高活力原生质体；
14、所述w5溶液包括：mes 0.002mol/l，nacl 0.154mol/l，cacl20.125mol/l和kcl0.005mol/l；
15、所述mmg溶液包括：mes溶液0.04mol/l，甘露醇0.4～0.5mol/l和mgcl20.015mol/l；
16、所述wi溶液包括mes溶液0.04mol/l，甘露醇0.4～0.5mol/l和kcl0.02mol/l；
17、所述转化缓冲液包括：peg40000.4g/ml，甘露醇0.4～0.5mol/l和cacl20.1mol/l。
18、优选的，所述避光转化的条件为：28℃恒温避光转化30min。
19、优选的，所述棉花原生质体悬浮液、含有目的基因的质粒溶液和转化缓冲液的体积比为10:1:11；所述棉花原生质体悬浮液中原生质体的浓度为2×106个/ml，所述含有目的基因的质粒的浓度为800ng/μl～2500ng/μl。
20、本专利技术还提供了上述技术方案所述的转化方法在下述一项或多项中的应用：
21、(a)棉花亚细胞定位；
22、(b)体细胞杂交；
23、(c)遗传转化；
24、(d)植株再生。
25、有益效果
26、本专利技术属于植物分子育种
，具体涉及一种棉花原生质体的制备方法。由于黄化苗生长时缺乏光照，其子叶薄软，细胞壁相比正常苗更脆弱，本专利技术通过选择更易酶解，且原生质体的转化效率比绿色子叶更高的棉花黄化苗子叶或棉花黄化苗愈伤组织作为外植体，并通过实验处理减少干扰条件，优化酶解液的配比，在棉花中构建了省时、高效的原生质体提取方法。
27、本专利技术对不同的棉花材料进行原生质体提取转化时，针对不同材料间内源物含量的差异选取不同渗透压的酶解液和wi、mmg等溶液；本专利技术所提供的棉花原生质体转化体系适用于所有无叶绿体的棉花原生质体，能显著缩短原生质体培养的时间以及提高原生质体转化效率，从外植体到获得成功表达gfp的原生质体只需13小时，可以快速获得高通量高活性的原生质体，采用该方法获得的高通量高活性原生质体可应用于棉花亚细胞定位、体细胞杂交、遗传转化、植株再生等领域。
28、获得棉花真叶至少需要一个月时间，获得棉花正常绿色子叶也需要至少一周，而选择没有叶绿体的黄化苗只需要3～4天；本专利技术选择黄化苗不仅减少了外植体培养的时间，通过温度控制可以缩短转化后的gfp表达时间，相比于现有技术的过夜表达，最快只需4.5h即可观测到原生质体中质粒的gfp荧光。除种植黄化苗外的实验时间不超过13h，总体系时间不超过5天，对于提高实验效率、快速推进后续实验有重要意义。
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1.一种棉花原生质体的制备方法，其特征在于，包括：将棉花材料和酶解液混合，真空渗透后酶解；对所得酶解料液进行分离，得到所述棉花原生质体；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述棉花黄化苗子叶为严格避光、生长至两片子叶刚刚分离的状态。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液与棉花材料的用量比为10mL：0.3～1g；所述酶解的转速为55rpm，时间为4～5h，温度为20～28℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真空渗透的条件为避光，压强0.06～0.08MPa，时间为30min；所述分离的方式包括用孔径大小为40μm的细胞筛进行过筛分离。
6.权利要求1～5任一项所述的制备方法在原生质体瞬时转化中的应用。
7.一种棉花原生质体的转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的转化方法，其特征在于，所述避光转化的条件为：28℃恒温避光转化30min。
9.根据权利要求7所述的转化
10.权利要求7～9任一项所述的转化方法在下述一项或多项中的应用：
...【技术特征摘要】
1.一种棉花原生质体的制备方法，其特征在于，包括：将棉花材料和酶解液混合，真空渗透后酶解；对所得酶解料液进行分离，得到所述棉花原生质体；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述棉花黄化苗子叶为严格避光、生长至两片子叶刚刚分离的状态。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液与棉花材料的用量比为10ml：0.3～1g；所述酶解的转速为55rpm，时间为4～5h，温度为20～28℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真空渗透的条件为避光，压强0.06～0.08mpa，时间为30min；所述分离的方式包括用孔径...
【专利技术属性】
技术研发人员：王茂军，罗宣宣，张献龙，张宇琪，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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