【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞标识，具体涉及一种脊髓组织凋亡细胞的染色方法。
技术介绍
1、细胞凋亡中,染色体dna双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-oh末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(tdt)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到dna的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal
2、-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,tunel)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有dna的断裂，因而没有3'-oh形成，很少能够被染色。
3、tunel染色是一种检测细胞凋亡的方法，是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。其原理是标记(荧光或者生物素)的dutp在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(tdtenzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的dna的3’－oh末端，再通过荧光激发或者化学显色的方法，特异准确地检测发生凋亡的细胞。
4、脊髓损伤(spinal cordinjury，sci)是一个普遍存在的公共卫生问题。全球创伤性脊髓损伤发生率为每年130/百万。随着社会公共交通和城市化进程的加速发展
5、脊髓损伤后有大量的细胞的死亡，给与治疗干预之后细胞死亡的减少可作为该项治疗是否有效的指标之一。但是市面上的tunel试剂盒染色方法因其步骤繁多，且无明确用于脊髓组织的方法，很难成功染出凋亡细胞，并且在染色过程中，脊髓组织因受损后中心烂掉容易脱落，导致需观察区域不完整而影响实验结果。因此，本领域亟需一种能够防止脊髓组织切片的脱落、提高tunel染色成功率以及效率的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种脊髓组织凋亡细胞的染色方法，可以高效地对脊髓组织凋亡细胞进行染色。
2、本专利技术为了实现其目的，采用的技术方案是：
3、一种脊髓组织凋亡细胞的染色方法，包括如下步骤：
4、1)准备脊髓损伤组织切片；
5、2)在载玻片的脊髓组织上面滴加pbs溶液去除脊髓组织切片上的oct，使用热风吹载玻片背面使脊髓组织牢固贴于载玻片上；
6、3)使用免疫组化笔将脊髓组织圈画出来，在每个组化圈中滴加固定液，室温下孵育；
7、4)pbs溶液润洗：将pbs溶液滴加在脊髓组织旁，让pbs溶液慢慢渗入脊髓组织中；
8、5)将玻片完全浸入柠檬酸钠抗原修复液进行组织修复，放入微波炉中火煮沸2-4min，拿出后降至室温；
9、6)在玻片样本上滴加proteinase k工作液，使脊髓组织样本被全部覆盖，室温孵育；
10、7)用pbs溶液润洗样本，去掉多余液体；
11、8)5％triton x-100(曲拉通x-100)+5％牛血清按照体积比1:1.7-2.5的比例充分混匀，清润在组织上使其完全覆盖脊髓组织，室温处理17-25min，用pbs溶液润洗样本，去掉多余液体；
12、9)平衡：滴加平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育；
13、10)标记液配制：配制tdt孵育缓冲液；
14、11)标记：尽量去掉载玻片上的平衡缓冲液，然后加入tdt孵育缓冲液，在35-39℃避光孵育0.8-1.5h；
15、12)用pbs溶液润洗组织样本，清洗2-5次；
16、13)滴加dapi染色液滴加在脊髓组织上进行染色，样本染色完成后，用pbs溶液清洗组织样本，去掉多余液体，滴加抗荧光淬灭封片剂封片。
17、优选地，步骤4)、7)、13)中pbs溶液润洗2-4次。
18、优选地，步骤6)中proteinase k工作液的浓度为20μg/ml，室温孵育8-12min。
19、优选地，步骤9)中室温孵育8-12min；步骤13)中dapi染色液采用pbs缓冲液将dapi染色液原液按照1:500稀释后用于染色，滴加dapi染色液后室温放置8-10min。
20、优选地，步骤11)中在37℃避光孵育1h；
21、优选地，所有步骤中pbs溶液润洗，每次润洗4-7min。
22、优选地，步骤2)中使用吹风机的中档热风吹载玻片背面直至脊髓组织由透明状变为白色。
23、优选地，步骤1)中脊髓损伤组织切片的制备方法为：将获得的脊髓组织在固定液中处理20-28h后使用不同浓度的蔗糖梯度脱水：17-19％蔗糖溶液处理22-26h，23-25％蔗糖溶液处理22-26h，29-31％蔗糖溶液中放置3-5天；将脊髓组织放入oct包埋剂中速冻，进行脊髓纵行切片，使用玻璃载玻片贴片保存在冰箱中。
24、优选地，所述固定液为4％多聚甲醛溶液；步骤3)中滴加固定液后室温下孵育8-12min。
25、优选地，步骤1)中脊髓损伤组织切片的制备方法为：将获得的脊髓组织在4％多聚甲醛溶液处理23-25h后使用不同浓度的蔗糖梯度脱水：18％蔗糖溶液处理23-25h，24％蔗糖溶液处理23-25h，30％蔗糖溶液中放置3-5天；将脊髓组织放入oct包埋剂中速冻到-20℃，进行脊髓纵行切片，使用玻璃载玻片贴片保存在冰箱中。
26、本专利技术的有益效果是：为脊髓损伤组织检查提供完整的tunel染色方法，提高脊髓tunel染色的成功率以及检出率。通过增加的实验环节提高染色率：如果没有步骤2)中采用热风将脊髓组织完成吹干这一步，则后续过程中脊髓及其容易脱落，导致组织不完整；如果没有步骤5)中柠檬酸钠修复这一步，那么凋亡细胞最终不能成功染上色。
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1.一种脊髓组织凋亡细胞的染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤4)、7)、13)中PBS溶液润洗2-4次。
3.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤6)中Proteinase K工作液的浓度为20μg/mL，室温孵育8-12min。
4.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤9)中室温孵育8-12min；步骤13)中DAPI染色液采用PBS缓冲液将DAPI染色液原液按照1:500稀释后用于染色，滴加DAPI染色液后室温放置8-10min。
5.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤11)中在37℃避光孵育1h。
6.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：所有步骤中PBS溶液润洗，每次润洗4-7min。
7.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤2)中使用吹风机的中档热风吹载玻片背面直至脊髓组织由透明状变为白色。
8.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤1)中脊髓损伤组织切片的制备方法为：将获得的脊髓
9.根据权利要求1或8所述的染色方法，其特征在于：所述固定液为4％多聚甲醛溶液；步骤3)中滴加固定液后室温下孵育8-12min。
10.根据权利要求8所述的染色方法，其特征在于：步骤1)中脊髓损伤组织切片的制备方法为：将获得的脊髓组织在4％多聚甲醛溶液处理23-25h后使用不同浓度的蔗糖梯度脱水：18％蔗糖溶液处理23-25h，24％蔗糖溶液处理23-25h，30％蔗糖溶液中放置3-5天；将脊髓组织放入OCT包埋剂中速冻到-20℃，进行脊髓纵行切片，使用玻璃载玻片贴片保存在冰箱中。
...【技术特征摘要】
1.一种脊髓组织凋亡细胞的染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤4)、7)、13)中pbs溶液润洗2-4次。
3.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤6)中proteinase k工作液的浓度为20μg/ml，室温孵育8-12min。
4.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤9)中室温孵育8-12min；步骤13)中dapi染色液采用pbs缓冲液将dapi染色液原液按照1:500稀释后用于染色，滴加dapi染色液后室温放置8-10min。
5.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤11)中在37℃避光孵育1h。
6.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：所有步骤中pbs溶液润洗，每次润洗4-7min。
7.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于：步骤2)中使用吹风机的中档热风吹载玻片背面直至脊髓组织由透明状变为白色。...
【专利技术属性】
技术研发人员：王霞，肖农，周虎耀，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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