【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子标记，具体而言，涉及一种检测西瓜果皮硬度候选基因的引物组合、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、耐裂性是西瓜品种的一个重要性状，不耐裂的西瓜品种在果实发育中后期和采摘后容易裂果，导致丧失商品价值，从而造成经济损失，因此选育耐裂性好的品种是西瓜育种的一个重要指标。
2、对西瓜裂果性状的研究表明(程瑞等，苏梦系列西瓜果皮硬度相关性状分析，2021)，裂果为数量性状，受果皮显微结构、内含物含量等因素影响，其中不同耐裂性西瓜品种果皮硬度存在明显差异，果皮硬度大的品种耐裂性更好，因此，西瓜果皮硬度与耐裂性显著正相关，可作为评价西瓜耐裂性的主要指标。cierf4基因是影响西瓜果皮硬度的关键基因，和耐裂的西瓜相比，易裂果西瓜中cierf4基因编码区存在一个碱基突变和11bp的片段缺失，从而导致移码基因翻译提前终止。基于cierf4基因碱基突变和插入缺失而开发的kasp标记，由于依赖特定荧光通道仪器和专用高保真聚合酶，仪器和试剂的昂贵导致该基因的标记在育种实践中应用并不多。
3、双向等位基因特异性pcr(bi-directional pcr amplification of specificalleles，bi-pasa)，即在一个pcr反应体系里可同时检测两对引物扩增的等位基因片段，是一种操作简单的等位基因分型方法。但常用的bi-pasa特异引物在设计过程中，会人为的引入错配碱基来增强等位基因产物特异性，这需要多对引物组合和合适的引物浓度匹配，甚至依赖高保真dna聚合酶，这对于bi-pasa引物的利用造成
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种检测西瓜果皮硬度候选基因的引物组合、试剂盒及其应用，以解决现有技术中检测西瓜果皮硬度候选基因成本过高的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4基因型的引物组合，该引物组合包括如seq id no：1所示的上游内引物、如seq idno：2所示的下游内引物、如seq id no：3所示的下游外引物和如seq id no：4所示的上游外引物。
3、为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组合。
4、进一步地，上述试剂盒中还包括pcr扩增缓冲液。
5、进一步地，上述的试剂盒中还包括dna聚合酶。
6、为了实现上述目的，根据本专利技术的第三个方面，提供了一种检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4的方法，该方法包括：提取西瓜植株的基因组dna；以西瓜植株的基因组dna为模板，利用上述的检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4的引物组合或上述的试剂盒进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；对pcr扩增产物进行电泳检测，根据检测结果判断西瓜植株的基因组dna中的西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型。
7、进一步地，西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型的判断标准为：当pcr扩增产物存在一条长为156bp的条带和一条长为466bp的条带或只存在一条长为156bp的条带时，西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型为aa基因型；当pcr扩增产物存在一条长为328bp的条带和一条长为455bp的条带或只存在一条长为328bp的条带时，西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型为bb基因型；当pcr扩增产物存在一条长为156bp的条带、一条长为328bp的条带和一条长大于400bp的条带或存在一条长为156bp的条带和一条长为328bp的条带时，西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型为ab基因型。
8、进一步地，pcr扩增的程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，55-58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸2min；12℃保存。
9、为了实现上述目的，根据本专利技术的第四个方面，提供了一种判断西瓜果皮硬度的方法，该方法包括：利用上述的方法对西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型进行检测；以西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型判断西瓜果皮为易裂或耐裂。
10、进一步地，西瓜果皮硬度的判断标准为：当西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型为aa时，西瓜果皮为耐裂；当西瓜果皮硬度候选基因cierf4的基因型为bb或ab时，西瓜果皮为易裂。
11、为了实现上述目的，根据本专利技术的第五个方面，提供了一种上述的引物组合，或上述的试剂盒，或上述的检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4的方法，或上述的判断西瓜果皮硬度的方法在西瓜果皮硬度检测中的应用。
12、应用本专利技术的技术方案，利用本申请的用于检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4的引物组合，通过简单pcr扩增对西瓜cierf4基因型分型，可准确辅助选择西瓜果皮硬度育种过程中回交和自交后代的目标基因型，检测特异性强，结果易读，成本低廉，可为西瓜商业育种提供一种快速筛选的工具，推动基因cierf4在西瓜果皮硬度性状改良中的高效应用。
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1.一种检测西瓜果皮硬度候选基因CIERF4基因型的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括如SEQ ID No：1所示的上游内引物、如SEQ ID No：2所示的下游内引物、如SEQIDNo：3所示的下游外引物和如SEQ ID No：4所示的上游外引物。
2.一种检测西瓜果皮硬度候选基因CIERF4的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR扩增缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA聚合酶。
5.一种检测西瓜果皮硬度候选基因CIERF4的方法，其特征在于，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述西瓜果皮硬度候选基因CIERF4的基因型的判断标准为：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性2min；
8.一种判断西瓜果皮硬度的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
10.权利要求1所述的引物组合，或权利要求2-4中任一项所述的试剂盒，或权利要求5-7中任一项所述的检测西瓜果皮硬度候选基因CIERF4的方法，或权利要求9或10所述的判断西瓜果皮硬度的方法在所述西瓜果皮硬度检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4基因型的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括如seq id no：1所示的上游内引物、如seq id no：2所示的下游内引物、如seqidno：3所示的下游外引物和如seq id no：4所示的上游外引物。
2.一种检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括pcr扩增缓冲液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括dna聚合酶。
5.一种检测西瓜果皮硬度候选基因cierf4的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛丽芳，邓云，路梦雪，楚箫，张兴平，
申请(专利权)人：北京大学现代农业研究院，
类型：发明
国别省市：
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