【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体涉及一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法。
技术介绍
1、这里的陈述仅提供与本专利技术相关的
技术介绍
，而不必然地构成现有技术。
2、d-塔格糖是近年发现的一种具有特殊功能的甜味剂，是果糖的“差向异构体”，甜度是蔗糖的92％，不产生不良风味和后味，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等功能。且经过测试发现，d-塔格糖没有毒性和致癌效应，在食品工业上可以安全使用。
3、d-阿洛酮糖同样是果糖的“差向异构体”，具有蔗糖甜度的70％,但产生的能量仅有蔗糖的0.3％，是一种安全甜味剂。除此以外，d-阿洛酮糖还具有多种生理功能，如，能够有效用于肥胖症、糖尿病、高血脂等疾病的预防和治疗，同时还具有抗炎、抗氧化、防治神经组织退化和动脉粥样硬化等潜在功能，因此在食品、化妆品、医药等领域都具有巨大的应用价值。
4、自然界中的d-塔格糖主要存在于热带常青树树胶、苔藓、地衣、热可可、奶酪和酸奶中，含量及其微少。同样d-阿洛酮糖在自然界存量很少，仅有少量的d-阿洛酮糖存在于甘蔗糖蜜、小麦和鼠刺属植物中。从这些物质中直接提取d-塔格糖和d-阿洛酮糖所需原材料用量大，成本非常高，难以实现d-塔格糖和d-阿洛酮糖的大规模工业化生产。
5、d-塔格糖的生产目前大多为单酶法进行生物合成，l-阿拉伯糖异构酶(l-arabinoseisomerase,l-ai)是目前生物合成d-塔格糖研究最多的一种酶，可以催化d-半乳糖为d-塔格糖。虽然转化率较高，最高可达79.7％，但d
6、d-阿洛酮糖的生产同样为单酶法，以果糖为底物，通过d-阿洛酮糖-3-差向异构酶反应生成d-阿洛酮糖，虽然此反应底物价格便宜，但是果糖(即底物)和阿洛酮糖(即产物)之间存在一定水平的反应平衡(产物/底物＝约20％至35％)。因此，在使用单一酶反应生产高纯度的阿洛酮糖的情况下，需要从反应生成物中分离和移除高浓度果糖的附加纯化过程。
7、所以，d-塔格糖和d-阿洛酮糖的生产方法存在的较高的原料成本、昂贵的产物和副产物分离成本以及相对较低的产物收率而限制了其应用。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法。该方法是采用多级酶级联反应的催化路径。用该方法制备d-塔格糖和d-阿洛酮糖，具有成本低、产率高等优点，适合规模化同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖。
2、为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：
3、一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：将金属离子、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，ppgk)、聚磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，pgi)、d-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶(d-tagatose 1,6-bisphosphate aldolase，gatz)和磷酸塔格糖磷酸酶(tpp)或6-磷酸塔格糖差向异构酶加入d-葡萄糖底物的缓冲溶液中，调节溶液ph值为4-9，进行四酶级联反应，同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖。
4、在以上d-塔格糖和d-阿洛酮糖的同时生产方法中，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶用于将d-葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，在该过程中，ppgk以葡萄糖与聚磷酸盐为底物，催化葡萄糖获得一分子磷酸，生成葡萄糖-6-磷酸，其中底物聚磷酸盐中的磷酸二酯键的能量相当于atp，可以直接或间接被利用，无需再额外添加atp帮助磷酸基团的转移，节省成本，适合工业化生产；
5、葡萄糖-6-磷酸异构酶用于将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；
6、d-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶或6-磷酸塔格糖差向异构酶用于将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸和阿洛酮糖-6-磷酸，在实验过程中，专利技术人发现gatz的底物特异性不专一，gatz在将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸的同时，会生成阿洛酮糖-6-磷酸，利用gatz的这一反应特性，开发一种同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的生产工艺。
7、磷酸塔格糖磷酸酶用于将塔格糖-6-磷酸或阿洛酮糖-6-磷酸的磷酸基团发生脱磷酸反应，转化为d-塔格糖和d-阿洛酮糖。
8、
9、金属离子的加入可以促进反应的进行。
10、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，ppgk)，可以来源于corynebacterium diphtheria，propionibacterium shermanii，mycococcuscoralloudes，microlunatus phosphovorus，arthrobacter sp，thermobifida fusca；优选地，所述聚磷酸依赖型葡萄糖激酶(ppgk)来源于thermobifida fusca。
11、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,pgi)，可以来源于thermus thermophilus，clostridium thermocellum，escherichia coli，优选地，所述葡萄糖-6-磷酸异构酶(pgi)来源于thermus thermophilus。
12、d-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶(d-tagatose 1,6-bisphosphate aldolase，gatz)可以来源于caldilinea sp.,anaerolineae bacterium，chloroflexota bacterium，优选地，所述d-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶(gatz)来源于caldilinea sp。
13、6-磷酸塔格糖磷酸酶(tpp)，可以来源于archaeoglobus fμlgidus，escherichiacoli，sphaerobacter thermophilus，actinomycetota bacterium，优选地，所述6-磷酸塔格糖磷酸酶来源于actinomycetota bacterium。
14、在一些实施例中，反应体系中，金属离子选自mn2+、mg2+、co2+、ca2+或cu2+。
15、优选的，所述金属离子为mg2+。
16、金属离子的作用分别为：稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象；作为酶的活性中心的组成成分，参与构成酶的活性中心；作为桥梁，将底物分子与酶蛋白螯合起来。
17、以t6pp为例基于tpp的晶体结构使用塔格糖作为潜在底物进行分子对接。从晶体结构分析，had家族磷酸酶保守区域，根据其催化机理，底物与金属mg2+络合，有利于提高蛋白活性。
18、优选的，金属离子的浓度为1-50mm。
19、进一步优选的，金属离子的浓度为10-30本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：将金属离子、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、聚磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸异构酶、D-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶或6-磷酸塔格糖差向异构酶加入D-葡萄糖底物的缓冲溶液中，调节溶液pH值为4-9，进行四酶级联反应，同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖。
2.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，金属离子选自Mn2+、Mg2+、Co2+、Ca2+或Cu2+，金属离子的浓度为1-50mM。
3.根据权利要求2所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述金属离子为Mg2+。
4.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.2％-1％，％为质量百分数；
5.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，葡萄糖-6-磷酸异构酶的浓度为1％-2％，6-磷酸
6.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：溶液的pH值为7-9。
7.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：四酶级联反应的温度为40-80℃。
8.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：D-葡萄糖底物的浓度为50-300g/L。
9.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述聚磷酸盐为三聚磷酸盐或六偏磷酸盐，所述六偏磷酸盐的浓度为0.01-0.5M。
10.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产D-塔格糖和D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系的缓冲液为HEPPS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：将金属离子、聚磷酸依赖型葡萄糖激酶、聚磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸异构酶、d-塔格糖1,6-二磷酸醛缩酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶或6-磷酸塔格糖差向异构酶加入d-葡萄糖底物的缓冲溶液中，调节溶液ph值为4-9，进行四酶级联反应，同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖。
2.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，金属离子选自mn2+、mg2+、co2+、ca2+或cu2+，金属离子的浓度为1-50mm。
3.根据权利要求2所述的由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述金属离子为mg2+。
4.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，聚磷酸依赖型葡萄糖激酶的浓度为0.2％-1％，％为质量百分数；
5.根据权利要求1所述的由葡萄糖同时生产d-塔格糖和d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：反应体系中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹珊，蒋怡，韦红夫，盖晓燕，李广喜，魏秀静，程保华，郑海军，安洪江，姜海燕，梅翠苗，尹卫疆，
申请(专利权)人：山东三元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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