【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物医药，具体涉及一种靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体、筛选方法及其应用。
技术介绍
1、食管癌是全球范围内常见的消化系统肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位列所有恶性肿瘤的第七位和第六位，在我国食管癌的发病率及死亡率分别位列第六位和第四位。食管癌的组织学分型主要为鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，escc)和腺癌(esophageal adenocarcinoma，eac)。在我国，食管鳞癌占食管癌患者总发病率的90％以上，由于其早期症状主要表现为胸骨后不适、烧灼感，可有食物通过缓慢或轻度哽噎感，持续时间长短不一，甚至可无症状，故70％左右的患者就诊时即已发生浸润或远处转移。早期食管癌的治疗主要以手术切除病灶为主，但大部分病人诊断时已处于中晚期，即便提高手术切除率，远期疗效仍不理想。中晚期食管癌尽管通过手术、放疗、化疗及免疫治疗等多学科联合治疗后，生存率仍不理想。由于其预后较差，确诊后食管癌患者的5年生存率只有20％左右。因此，食管鳞癌的早期诊断以及靶向治疗对于控制肿瘤发展具有十分重要的生命意义。从基因工程角度而言，研究开发食管鳞癌相关诊断及治疗靶点，可为食管鳞癌的预防和治疗奠定基础。
2、核酸适配体(aptamer)是指一段长度在100nt以内的单链rna(ssrna)或单链dna(ssdna)序列。系通过全细胞指数富集的配基系统进化技术(cell systematic evolutionof ligands by exponential enrichme
技术实现思路
1、本专利技术基于cell-selex技术，以kyse150细胞为正向细胞，heec细胞为反向细胞，通过反复多轮筛选，获得一条可与食管癌活细胞高特异性、高亲和力结合的核酸适配体ea1，为食管鳞癌的临床精准诊断、个性化治疗及药物靶向递送提供了高效简便的分子工具。
2、本专利技术的目的之一是提供一种能与食管鳞癌细胞特异性结合的核酸适配体；目的之二是提供核酸适配体ea1的筛选方法；目的之三是提供上述核酸适配体的应用。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体为寡核苷酸适配体ea1，由以下序列之一组成：
4、(1)seq id no.1所示的核苷酸序列；
5、(2)以seq id no.1所示的核苷酸序列为核心向3’端或5’端延伸的序列；
6、(3)seq id no.1所示的核苷酸序列经插入、替换、缺失而形成的具有同等功能的序列。
7、一种寡核苷酸适配体ea1的衍生物，所述寡核苷酸适配体ea1衍生物为寡核苷酸适配体ea1对碱基序列进行化学修饰，或在所述适配体ea1的5’端或3’端连接以下物质中的至少一种：荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna和酶标记。
8、进一步的，寡核苷酸适配体ea1或寡核苷酸适配体ea1衍生物与食管鳞癌靶细胞或组织具有高亲和力和特异性。
9、一种上述的靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体的筛选方法，所述寡核苷酸适配体ea1系通过全细胞指数富集的配基系统进化技术筛选获得，包括以下步骤：
10、步骤1：文库的构建及相关引物设计：
11、筛选所用文库为单链dna文库，ssdna总长度为79nt，中间为32nt的随机序列，5’端与3’端各有一个23nt和24nt的引物序列，可表示为：5’agcctaagcctgtccaggaatcg-32n-atggcttagtggcacgattaggtc3’；
12、文库制备过程中，所有dna单链正向引物的5’端均带有fam荧光染料，以便后续使用流式细胞仪测定结合情况，可表示为：
13、5’fam agcctaagcctgtccaggaatcg3’
14、所有dna单链反向引物的5’端均带有生物素标记，以便于通过链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠分离正义链与反义链，从而用于后续筛选，可表示为：
15、5’biotin gacctaatcgtgccactaagccat3’；
16、步骤2：cell-selex筛选：
17、第1轮至第4轮初步筛选过程中，将ssdna文库溶解于结合缓冲液中，95℃加热5min使其变性，迅速置于冰上；之后与靶细胞kyse150于4℃孵育60min；孵育完成后，使用洗涤缓冲液洗脱未与靶细胞结合的ssdna，洗脱1次，收集结合的ssdna；以上清中的ssdna文库为模板，pcr扩增产生双链dna，然后再以此dsdna为模板行不对称pcr扩增产生ssdna；
18、第5轮至第8轮的复筛过程中，同法操作，压力性筛选条件孵育时间改为45min；
19、第9轮至第12轮的复筛过程中，同法操作，压力性筛选条件孵育时间改为45min，洗脱2次；
20、第13轮至第20轮的复筛过程中，同法操作，压力性筛选条件孵育时间改为30min，洗脱2次；其中第14，16，18轮以heec细胞为对照细胞，进行反筛选；具体方法为heec细胞与ssdna文库于4℃孵育30min，使用洗涤缓冲液洗脱与对照细胞结合的ssdna，收集未结合的ssdna；筛选产物得到富集后，将筛选出的ssdna进行克隆并测序；
21、步骤3：筛选富集结果：
22、在筛选富集过程中，对于筛选或富集的ssdna，每隔5轮判断筛选或富集的效果，测试复筛筛选富集产物是否达到饱和，对于达到饱和的富集产物进行高通量测序，得到测序结果后，通过重复数分析、同源性分析和进化树分析，综合筛选出多条寡核苷酸适配体序列，通过对这些寡核苷酸适配体序列进行序列比对和同源性分析，确定出对kyse150食管鳞癌细胞的亲和力最高寡核苷酸适配体ea1。
23、进一步的，步骤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体为寡核苷酸适配体EA1，由以下序列之一组成：
2.一种根据权利要求1所述寡核苷酸适配体EA1的衍生物，其特征在于：所述寡核苷酸适配体EA1衍生物为寡核苷酸适配体EA1对碱基序列进行化学修饰，或在所述适配体EA1的5’端或3’端连接以下物质中的至少一种：荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶标记。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体EA1或权利要求2所述寡核苷酸适配体EA1衍生物，其特征在于：所述寡核苷酸适配体EA1或寡核苷酸适配体EA1衍生物与食管鳞癌靶细胞或组织具有高亲和力和特异性。
4.一种根据权利要求1或2所述的靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：所述寡核苷酸适配体EA1系通过全细胞指数富集的配基系统进化技术筛选获得，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤2中第1轮至第20轮复筛过程中，对于筛选或富集结果实时进行电泳监测质控。
6.根据权利要求4所述的筛
7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤3中获得的EA1利用mFold软件对确定的EA1的二级结构进行模拟分析。
8.一种根据权利要求1或2所述的靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体的制备方法，其特征在于：采用体外化学合成或通过PCR扩增或其他分子生物学方法获得所述寡核苷酸适配体EA1。
9.一种根据权利要求1所述寡核苷酸适配体EA1或权利要求2所述寡核苷酸适配体EA1衍生物在以下任一方面的应用：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述用于食管鳞癌的生物标志物检测研究，包括食管癌疾病的发生、发展、进程相关基础研究。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体为寡核苷酸适配体ea1，由以下序列之一组成：
2.一种根据权利要求1所述寡核苷酸适配体ea1的衍生物，其特征在于：所述寡核苷酸适配体ea1衍生物为寡核苷酸适配体ea1对碱基序列进行化学修饰，或在所述适配体ea1的5’端或3’端连接以下物质中的至少一种：荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna和酶标记。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体ea1或权利要求2所述寡核苷酸适配体ea1衍生物，其特征在于：所述寡核苷酸适配体ea1或寡核苷酸适配体ea1衍生物与食管鳞癌靶细胞或组织具有高亲和力和特异性。
4.一种根据权利要求1或2所述的靶向食管鳞癌细胞的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：所述寡核苷酸适配体ea1系通过全细胞指数富集的配基系统进化技术筛选获得，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤2中第1轮至第20轮复筛过程中，对于筛选或富集结果...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓钟，王其龙，张莉，谢非，孙从永，
申请(专利权)人：淮安市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：
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