【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫测定领域，涉及一种血红蛋白-β-淀粉样肽(hb-aβ)复合物定量检测试剂盒、检测方法及应用，具体涉及定量检测外周血中hb-aβ复合物的试剂盒、方法及其应用，其中所述hb-aβ复合物主要来自外周血红细胞。
技术介绍
0、技术背景
1、β-淀粉样肽(amyloidβpeptide，aβ)是指由36～43个氨基酸构成的多肽分子，是β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，app)在β分泌酶的作用下产生的多肽降解产物。aβ可由神经元、星形胶质细胞、激活的小胶质细胞产生，并进入到细胞外液中，包括组织间隙液、脑脊液、血浆、淋巴液、唾液和尿液。aβ具有较强的聚集特性，尤其是由42个氨基酸构成的aβ1-42或aβ42；aβ异常聚集体通过直接作用于神经元或激活胶质细胞炎症反应等机制而对神经元产生毒性作用，是诱发阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)发生发展的重要原因。aβ异常聚集体在细胞外沉积形成ad的标志性病理结构—老年斑(senileplaque，sp)，后者是ad病理学和影像学诊断的主要依据。
2、鉴于aβ在ad的发病机制中起重要作用，并且在ad患者脑中形成标志性病理结构老年斑，aβ被认为是能够反映ad神经病理变化的核心标志物(core biomarker)。多年来，人们一直致力于研究有效的aβ检测方法和开放检测试剂盒。例如，fujirebio公司开发的innotestβ-amyloid(1-42)elisa检测试剂盒、euroimmun公司开发
3、然而，尽管ip-ms、pmca、imr、nde-aβ检测技术获得较好的诊断效果，但这些技术需要比较繁琐的样本处理过程(ip-ms、nde-aβ)、比较昂贵的设备(ip-ms、imr)、较多的样本量(nde-aβ)或较长的检测时间(pmca)；此外，由于血液中的红细胞含有高浓度的aβ，后者可以引起红细胞膜的稳定性下降和溶血，导致高浓度的aβ释放到血浆，影响血浆中的aβ测试的准确性。这些因素限制了上述技术测试血浆aβ的准确性及其临床应用，尤其是以社区高危人群筛查、疾病进展动态跟踪为目的的临床应用。
4、已知，循环外周血红细胞可以吸附并摄取血浆中的aβ，包括aβ40和aβ42；红细胞中含有丰富的aβ，其含量远高于血浆；ad病人的红细胞膜和胞浆中的aβ含量显著高于健康对照；aβ与红细胞相互作用可以诱发血管内溶血，导致大量aβ进入血浆，影响血浆或血清中aβ含量的准确测试。我们证明，红细胞中的aβ40和aβ42可以与血红蛋白(hemoglobin，hb)结合形成hb-aβ复合物，其含量在ad病人显著高于健康对照。因此，检测外周血红细胞中的hb-aβ复合物含量不仅可以作为另一种反映ad患者aβ病理的标志物，而且可以避免溶血等因素对血浆或血清中aβ含量测试的影响。
5、中国专利201711132802.8公开了一种定量检测hb-aβ复合物的elisa方法，该方法用抗hb抗体包被酶标板，作为捕获抗体，以生物素标记或酶标记的抗aβ抗体作为检测抗体，利用酶促色素或酶促化学发光反应显示待测hb-aβ复合物含量。中国专利cn103852579a公开了一种人体血清aβ的定量检测方法，其通过采用试剂盒预先铺有抗aβ肽结构n-端选择性氨基酸序列的特异的小鼠单克隆抗体与控温和定速离心处理过的血浆样本中的aβ进行捕获性免疫反应，得到反应复合物，将反应复合物与抗aβ特定氨基酸序列的兔抗人的aβ抗体进行二次抗原-抗体反应，再通过带有酶底物的兔抗鼠多克隆抗体进行显色反应后，分光光度仪定量测定。中国专利cn103547593a公开了用于确定淀粉样肽的抗体、试剂盒和方法，并具体公开了该试剂盒包括第一抗体和第二抗体，第一抗体能够特异性结合至aβ(1-17)肽，第二抗体能够识别不同于所述第一抗体所识别的区域的所述aβ(1-17)肽的区域。其检测样品时，用与aβ(1-17)肽特异性结合的第一抗体捕获样品中存在的所述肽，用第二抗体接触第一抗体所捕获的肽，形成免疫复合物而进行测定。
6、上述专利所涉及的aβ检测方法面临以下问题：1)中国专利20171113280本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Hb-Aβ复合物的定量检测方法，所述Hb-Aβ复合物来自外周血红细胞，所述方法包括，将Protein G或链霉亲和素(Streptavidin，SA)固定在固相载体上，随后加入抗Hb抗体(AHb)或生物素化抗Hb抗体(B-AHb)形成结合体，并与样本中的Hb-Aβ复合物反应，随后分别与酶标抗Aβ抗体(E-AAβ)、化学发光液反应的步骤或分别与生物素标记抗Aβ抗体(B-AAβ)、酶标记亲和素(E-SA)、化学发光液进行反应的步骤；其中，AAβ可以是特异性识别Aβ42、Aβ40或任何其它Aβ肽的抗体；在酶标记AAβ或酶标记亲和素的反应步骤中，向反应液中加入聚乙二醇(PEG)；其中所述PEG的浓度为0.1～12％，优选的为2～8％，更为优选的为5％。
2.根据权利要求1所述的检测方法，进一步包括，血液样本的收集，在含有PEG的液相反应液中形成Hb-Aβ-AAβ复合物，采用发光法对抗原抗体结合物进行检测的步骤。
3.根据权利要求1所述的检测方法，方法如下：
4.根据权利要求1所述的检测方法，
5.根据权利要求1所述的检测方法，>
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的检测方法，所述方法包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的检测方法，所述方法、步骤如下：
9.根据权利要求1所述的检测方法，为计算待测样本中Hb-Aβ复合物的含量，需要配制Hb-Aβ复合物标准品，其配制方法如下；
10.一种检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性抗Hb抗体(AHb)，固相载体，Protein G，PEG；所述试剂盒还可以含有抗Aβ抗体(AAβ)，发光剂，生物素或酶，必要的溶剂，使用说明书；所述试剂盒还可以包括Hb-Aβ标准品，链霉亲和素(SA)，生物素标记的抗Aβ抗体(B-AAβ)，或酶标记的抗Aβ抗体(E-AAβ)；还可以包括酶标记的亲和素(E-SA)，其可特异性的与B-AAβ相结合；所述酶为可以催化化学发光反应的酶，如碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)或葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GO)；所述试剂盒还可以包括荧光素、胶体金等其它物质标记的抗体或亲和素，所述抗体可特异性的与抗Aβ抗体相结合，所述试剂盒还可以包括缓冲液、封闭液；所述PEG可以是任何分子量的PEG，包括PEG-200～PEG-20000，优选的为PEG-4000～PEG-8000，更优选的为PEG-6000；本专利技术进一步包括，所述试剂盒中的试剂在制备检测阿尔茨海默病试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种hb-aβ复合物的定量检测方法，所述hb-aβ复合物来自外周血红细胞，所述方法包括，将protein g或链霉亲和素(streptavidin，sa)固定在固相载体上，随后加入抗hb抗体(ahb)或生物素化抗hb抗体(b-ahb)形成结合体，并与样本中的hb-aβ复合物反应，随后分别与酶标抗aβ抗体(e-aaβ)、化学发光液反应的步骤或分别与生物素标记抗aβ抗体(b-aaβ)、酶标记亲和素(e-sa)、化学发光液进行反应的步骤；其中，aaβ可以是特异性识别aβ42、aβ40或任何其它aβ肽的抗体；在酶标记aaβ或酶标记亲和素的反应步骤中，向反应液中加入聚乙二醇(peg)；其中所述peg的浓度为0.1～12％，优选的为2～8％，更为优选的为5％。
2.根据权利要求1所述的检测方法，进一步包括，血液样本的收集，在含有peg的液相反应液中形成hb-aβ-aaβ复合物，采用发光法对抗原抗体结合物进行检测的步骤。
3.根据权利要求1所述的检测方法，方法如下：
4.根据权利要求1所述的检测方法，
5.根据权利要求1所述的检测方法，
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的检测方法，所述方法包括以下步骤：
8.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：于顺，李鹏杰，李昕，蔡燕宁，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：
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