一种对mRNA单碱基定点编辑的组装pRNA纳米递送体及用于基因治疗制造技术

技术编号：40313160 阅读：7 留言：0更新日期：2024-02-07 20:55

本发明专利技术涉及基因治疗药物与细胞治疗方法。是基因错义突变造成细胞功能异常的新治疗方法，旨在对错义转录本mRNA进行突变点编辑，在细胞内源腺苷脱氨酶ADAR的作用下，将突变点腺嘌呤碱基脱氨基转换为次黄嘌呤，使突变点氨基酸改变、以改变蛋白功能而达成的基因治疗和细胞治疗。利用φ29噬菌体pRNA(在细菌膜打洞核酸注入菌体)自折叠组装为纳米颗粒、有刚性、韧性、还可自主递送进细胞的特点，重组此结构：将pRNA连接两段ADAR结合序列加突变点反义结合编辑序列组成，经克隆、转化于人肾细胞HEK 293T获编辑体外泌体；经用于绿色荧光蛋白编辑66位TAT为TGT致荧光消失，方法可行，对点突变疾病基因治疗有应用价值。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞治疗与基因治疗方法，及其治疗候选物的发现与应用，以基因转录后编辑为主，用于修改功能基因转录后所翻译的蛋白结构，改变蛋白功能从而开展的基因治疗、细胞治疗。依专利技术方法制备的产物能下调基因的功能进行该基因所致的疾病生物治疗。

技术介绍

0、技术背景

1、疾病治疗药物和技术，以人类体细胞的基因组、转录本组和蛋白质组三个层次的生物大分子为目标，基因治疗的基因药物主要针对致病基因的dna和基因转录本mrna两类生物大分子。我们一直认为mrna从结构上考虑是研发核酸药物的最理想靶标和策略。反义寡核苷酸、特异水解基因mrna的核酸酶(ribozyme和dnazyme)以及具有干扰作用的双链rna(sirna)是药物设计优选候选物。

2、因为，基因dna编辑技术如crispr/cas9等，存在的问题是其在临床治疗应用中存在困难。首先，dna结构复杂，难以解旋裸露解链结合靶定；其次，现有编辑体系依赖于外源编辑酶或效应蛋白表达，从而造成(1)蛋白分子量过大使得通过病毒载体进行装载及人体内递送十分困难；(2)由蛋白过表达引起的dna/rna水平的脱靶效应；(3)由外源蛋白表达引起的机体免疫反应及损伤；(4)机体内的预存抗体使外源编辑酶或效应蛋白被中和从而导致基因编辑失败等。

3、为避免上述问题，需建立新型基因编辑技术方法。作用于mrna的干预分子可以通过工程化制备。比如表达载体转录生成大量pre-mirna，在细胞中包裹成为mirna外泌体，自然分泌到细胞外，以外泌体形式，经验证可以进入肿瘤细胞

4、因此，本专利技术基于a-to-i mrna编辑adar工作原理。设计上，利用噬菌体φ29的、噬菌体在细菌细胞膜打洞将核酸注入菌体、能三联体聚合自组装的prna结构，加上adar识别序列结构，两种三个结构重组prna纳米颗粒——文中称为″prna 3h组装纳米颗粒″，针对某个基因也称为″prna 3h～xxx定点编辑纳米颗粒″在细胞外泌体中分泌，对靶细胞结合、下调和失活靶基因功能；该纳米颗粒作为药物先导物，可为一种新的基因治疗技术应用。

技术实现思路

1、本专利技术为一种定点靶向mrna单碱基、编辑单碱基的″prna 3h组装纳米颗粒″制备技术，采用噬菌体φ29的prna 3h三联体聚合rna自组装结构、重组入两个adar识别结构基序，形成自组装纳米颗粒产物，应用于细胞功能基因的蛋白活性下调与失活，可用于对实验动物靶器官组织的基因表达下调，是基因治疗和细胞治疗技术创新和应用创新。

2、本专利技术经实验研究产生，
技术实现思路
为：

3、φ29的prna分子有三个发卡结构(3h)为：3ha、3hb和3hc，三个发卡上分别链接一个adar结合串基序、再一个adar结合串基序，和一个rna靶点结合序列(约＜20nt)、；三段重组序列依碱基互补结合自组装成一个三角形纳米颗粒。

4、所述重构的″prna 3h组装纳米颗粒″的功能为：3ha和3hb引导adar高效结合靶基因mrna的编辑位置，3hc定点结合靶基因mrna的编辑位点，adar能在两处结合集结而高效地发挥脱氨基化碱基编辑作用。

5、所述重构的″prna 3h组装纳米颗粒″制备，采用dna重组和细胞内表达：克隆入pgem-t载体克隆、再重组入prnat-u6.1/neo表达质粒；重组入prnat-u6.1/neo表达质粒转入人源细胞株，表达细胞株用人肾细胞hek 293t，可体外培养繁殖；在细胞培养中可以将″prna 3h组装纳米颗粒″以外泌体形式分泌出胞；

6、所述″prna 3h组装纳米颗粒″的外泌体制备，采用上述细胞培养液，通过超速离心分级分离，收集纯化而成。

7、所述″prna 3h组装纳米颗粒″的外泌体，可以在培养细胞中导入到细胞并靶定基因mrna，编辑其基因，失活基因表达。

8、靶定绿色荧光蛋白的″prna 3h～gfp定点编辑纳米颗粒″的外泌体，在培养细胞中靶定gfp基因mrna的编码66位酪氨酸的tat编辑后变为tgt、编辑后变为半胱氨酸，苯酚基团消失导致gfp高级结构失去苯环、荧光消失，在绿色荧光癌细胞、及绿色荧光癌细胞荷瘤动物检验有效。成功实现基因mrna单核苷酸编辑达到基因治疗。并为密码子gax(gaa，gac，gag和gat)设计编辑为ggx(gga，ggc，ggg和ggt)打下基础。

9、专利技术实施方式：

10、下面结合附图对本专利技术具体实施方式作进一步详细说明。材料方法为常规实验室条件可满足，所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。包括如下5个方面内容：

11、1、prna 3h细装纳米颗粒设计与定制

12、1.1、prna 3h片段设计

13、prna 3h片段，即prna 3hairpin。源于枯草杆菌噬菌体phi29 prna，它是核基因组包装递送序列，为在其前衣壳中120nt的小rna分子(图1.a)，由atp驱动分子马达(图1.e)，含有结合域(23-97nt)包装结构及prna分子间配对聚合结构(图1.b，c，g，i)。可装载保护携带rna分子不被酶降解，防止其在体内错误折叠、保持其序列靶向性。prna可装载达120ntrna分子、核酶、rna适配体(aptamer)，及化学分子基团.安全高效无免疫反应。mg2+存在下包装分子牢固韧性十足，近期研究证实在镁离子存在下prna自组装的三个臂(h，hairpin)的相互结合牢固，可以承受250皮牛的对向拉力而不会发生变形和键断裂，作为药物分子载体——纳米递送体，有优越的稳定性和耐用刚性。图1.显示phi29prna作为装载核苷酸片段颗粒(图1.a，c)，微颗粒大小约为0.5纳米(图1.j所示)，形成2/3聚体(图1.c，i，j，k)，能递送进入细胞(下图g，细胞内标记荧光的分子)，prna可以携带rna片段(图1的k，l)。prna装载纳米分子(http：//www.eng.uc.edu/nanomedi本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.″pRNA 3H组装mRNA定点编辑纳米颗粒″的设计，即：pRNA 3H的第一段发卡序列连接靶基因mRNA识别结合序列，其第二和第三段发卡均加入ADAR结合序列。

2.依权利要求1的″pRNA 3H组装mRNA定点编辑纳米颗粒″，于任何基因mRNA基因编辑中的应用。

3.依权利要求2，为基因治疗和细胞治疗提供mRNA定点核苷酸人工突变技术，在单核苷酸疾病的临床治疗应用。

4.依权利要求1的″pRNA 3H组装mRNA定点编辑纳米颗粒″通过人细胞表达，从细胞分泌出胞外，在外泌体中可以收集纯化为制品。

5.绿色荧光蛋白mRNA基因编辑中，采用定点编辑针对66位密码子TAT编辑为TGT、使该密码子蛋白序列从Tyrosin氨基酸突变为Cystine的应用。即对GFP核糖核酸密码子序列的胸腺嘧啶-腺嘌呤-胸腺嘧啶编辑变成胸腺嘧啶-鸟嘌呤-胸腺嘧啶、从而将其蛋白翻译从酪氨酸变成半胱氨酸。

【技术特征摘要】

1.″prna 3h组装mrna定点编辑纳米颗粒″的设计，即：prna 3h的第一段发卡序列连接靶基因mrna识别结合序列，其第二和第三段发卡均加入adar结合序列。

2.依权利要求1的″prna 3h组装mrna定点编辑纳米颗粒″，于任何基因mrna基因编辑中的应用。

3.依权利要求2，为基因治疗和细胞治疗提供mrna定点核苷酸人工突变技术，在单核苷酸疾病的临床治疗应用。

4.依...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛建平，邹晓阳，张海斌，
申请(专利权)人：福建军生精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人