【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白标准物质定值，特别是涉及一种白细胞介素-6的定值方法。
技术介绍
1、白细胞介素-6(interleukin-6,il-6)，简称白介素-6，是由212个氨基酸组成的多功能糖蛋白，是一种细胞炎性因子。它在健康人群体内含量很低，当机体受到细菌感染时，其含量与细菌感染程度呈正相关。il-6在机体病理和生理活动中发挥着多种作用，例如急性炎症反应、自身免疫性疾病、冠心病、肿瘤形成、脓毒症等。连续监测重症监护患者il-6的水平能够有效评估系统性炎症反应综合征的严重程度，脓毒症以及脓毒症性休克的预后情况。另外，il-6还能作为脓毒症的早期警告指标。
2、研究发现，2019-ncov感染的患者血清中炎症细胞因子显著升高，因此认为2019-ncov感染与“细胞因子风暴”有密切关系。患者血清中il-6的表达水平有助于新型冠状病毒感染的临床分型及预测疾病严重程度和患者预后。新型冠状病毒感染诊疗方法将外周血炎症因子il-6进行性上升作为新型冠状病毒感染重型、危重型临床预警指标。血清中il-6含量的测定对于多种疾病的诊断及预后具有重要的意义。
3、目前，国内尚未有il-6标准物质，英国生物标准和检定研究所(nibsc)研制的重组人白介素6(rhil-6)活性测定国际标准品(code89/548)，1.0×105iu/支，100,000iu/1.0ug为活性标准物质。但是，现有的标准物质无法实现蛋白含量的绝对定量。因此，研制量值准确、具有溯源性的标准物质具有迫切的需求。
4、氨基酸的同位素稀释质谱法为
5、因此，开发一种可实现白细胞介素-6绝对定量、测量结果可溯源至si单位的定值方法成为了本领域亟需解决的技术问题之一。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6定值方法。本方法采用肽段的同位素稀释质谱法进行定值，所选肽段为il-6的特异性肽段，特异性好，准确性高，测量结果可溯源至si单位kg。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
3、一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，包括以下步骤：
4、(1)特征肽段的选择：：白细胞介素-6溶液经胰蛋白酶酶解，酶解液通过飞行时间质谱与高分辨质谱分析，并筛选白细胞介素-6的三条特征肽段：ealaennlnlpk(ek)、eflqsslr(er)、vliqflqk(vk)，如seq id no：1-3所示；
5、(2)特征肽段的合成：合成特征肽段ek、er、vk及三条同位素标记肽段，三条同位素标记肽段的序列分别为eal(13c6,15n)aennlnlpk、efl(13c6,15n)qsslr、vl(13c6,15n)iqflqk，合成的三条特征肽段用于白细胞介素-6的定量；
6、(3)特征肽段纯度的准确定量：以亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标准物质，同位素标记13c9-苯丙氨酸、13c5-缬氨酸、13c5-脯氨酸、d10-亮氨酸为内标，分别采用氨基酸同位素稀释质谱法对合成的三条特征肽段进行定量；
7、(4)将白细胞介素-6经胰蛋白酶酶解：并对酶解时间，样品与酶的质量比进行优化，以酶切肽段与标记肽段质谱峰面积比作图，比值最高时的酶解时间作为il-6的最佳酶解时间，比值最高时样品与酶的质量比作为il-6前处理过程中样品与酶的质量比；；
8、(5)采用肽段的同位素稀释质谱法对酶解液中三条特征肽段进行准确定量；
9、(6)三条特征肽段液相条件、质谱条件的优化：确定特征肽段及同位素标记肽段母离子、子离子，并对质谱参数进行优化，采用高效液相色谱串联质谱对特征肽段进行质谱分析，采集方式采用多反应监测(mrm)模式；；
10、(7)分别计算酶解液中三条特征肽段的含量，以特征肽段的含量计算il-6的浓度作为白细胞介素-6标准物质的定值结果。
11、其中，所述白细胞介素-6的氨基酸序列如seq id no：4所示。
12、其中，所述步骤(2)中，化学合成三条特征肽段(ealaennlnlpk(ek)、eflqsslr(er)、vliqflqk(vk))和同位素标记特征肽段(eal(13c6,15n)aennlnlpk、efl(13c6,15n)qsslr、vl(13c6,15n)iqflqk)；合成的三条特征肽段用于白细胞介素-6的定量。
13、其中，所述步骤(3)中，特征肽段的准确定量，具体为：
14、1)分别采用氨基酸的同位素稀释质谱法对ek、er、vk进行准确定值，以亮氨酸、脯氨酸的同位素稀释质谱法对肽段ek进行准确定值，以亮氨酸、苯丙氨酸的同位素稀释质谱法对肽段er进行准确定值，以缬氨酸、苯丙氨酸的同位素稀释质谱法对vk进行准确定值，分别取两种氨基酸定值结果的平均值作为特征肽段的定值结果。
15、2)采用以下公式计算的特征肽段溶液的准确浓度。
16、
17、其中，caa：溶液中氨基酸的浓度，μg/g；
18、p：氨基酸标物纯度，％；
19、m标：肽段中加入标记氨基酸的质量，ng；
20、r样：样品中氨基酸色谱峰面积比，非标记/标记；
21、i1：高标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
22、i2：低标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
23、r1：高标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
24、r2：低标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
25、m：ek、er、vk溶液的质量，mg；
26、
27、式中，ci代表由氨基酸计算得到的特征肽段溶液的浓度，μg/g；caa代表溶液中氨基酸的浓度，μg/g；mi代表相应特征肽段的相对分子质量，da；maa代表每种氨基酸的相对分子质量，da；n代表ek、er、vk中对应氨基酸的个数。
28、其中，首先分别采用氨基酸的同位素稀释质谱法对三条特征肽段浓度进行准确定量，然后，根据样品的稀释倍数，对合成的三条特征肽段纯度进行准确定量；
29、采用以下公式计算合成的三条特征肽段的纯度：
30、
31、式中，pi代表ek、er、vk的纯度，％；ci代表测得ek、er、vk的浓度，μg/g；m1代表配置特征肽段溶液的质量，g；m2代表溶液中ek、er、vk的质量，μg。
32、其中，所述步骤(4)中，对il-6酶解时间，样品与胰蛋白酶的质量比进行优化，以酶切肽段与内标肽段质谱峰面积比作图，比值最高时的酶解时间作为il-6的最佳酶解时间，比值最高时样品与酶的质量比作为il-6前处理过程中样品与酶的质量比。确定白细胞介素-6酶解时间为12h，样品与胰蛋白酶酶的比例为30:1。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述白细胞介素-6的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(3)中，以亮氨酸、脯氨酸的同位素的稀释质谱法对肽段EK进行定量，以亮氨酸、苯丙氨酸对肽段ER进行定量，以缬氨酸、苯丙氨酸对VK进行定量。
4.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(4)中，酶解时间为12h，样品与胰蛋白酶酶的比例为30:1。
5.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：采用以下公式计算合成的特征肽段的含量，
6.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所用色谱柱为ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，2.1m
7.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(7)具体为，
8.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(3)中特征肽段纯度的准确定量，首先分别采用氨基酸的同位素稀释质谱法对三条特征肽段浓度进行准确定量，然后，根据样品的稀释倍数，对合成的三条特征肽段纯度进行准确定量；采用以下公式计算合成的三条特征肽段的纯度：
...【技术特征摘要】
1.一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述白细胞介素-6的氨基酸序列如seq id no：4所示。
3.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(3)中，以亮氨酸、脯氨酸的同位素的稀释质谱法对肽段ek进行定量，以亮氨酸、苯丙氨酸对肽段er进行定量，以缬氨酸、苯丙氨酸对vk进行定量。
4.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(4)中，酶解时间为12h，样品与胰蛋白酶酶的比例为30:1。
5.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：采用以下公式计算合...
【专利技术属性】
技术研发人员：燕茹，林婧，王丽华，陈心硕，季红梅，朱文，张雨晨，
申请(专利权)人：南京市计量监督检测院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。