【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于再生医学领域，涉及用于治疗脊髓损伤的生物制品，具体涉及原代小胶质细胞的培养以及利用其制备mirna修饰的m2型小胶质细胞。
技术介绍
1、小胶质细胞大体可分为静息态的m0型小胶质细胞、经典活化的m1型小胶质细胞和替代活化的m2型小胶质细胞。m1型小胶质细胞可由lps和ifn-γ等诱导产生，高表达标志分子tnf-α、il-6、il-1β和nos2等，具有细胞毒性、促炎症反应的作用；m2型小胶质细胞可由il-4等诱导产生，高表达标志分子arg1、tgf-β、il-10和ym1等，具有神经保护、促进组织修复、抑制炎症反应的作用。在损伤微环境的作用下，小胶质细胞主要活化成m1型，并持续存在于脊髓损伤区，而m2型小胶质细胞仅短暂出现，这可能是导致损伤区炎性进展和组织修复不良的原因之一。
2、微小rna(microrna，mirna)是长度约为22个核苷酸的非编码rna，其通过与靶基因mrna 3'-非翻译区(3'-untranslated region，3'-utr)结合，抑制靶基因蛋白翻译，进而调控细胞的生物学功能。mirna存在多种形式，最原始的是pri-mirna，长度大约为300～1000个碱基；pri-mirna经过一次加工后，成为pre-mirna即microrna前体，长度大约为70～90个碱基；pre-mirna再经过dicer酶酶切后，成为长度20～24nt的成熟mirna。mirna在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，引起研究人员越来越多的关注。
3、利用细胞移植
4、脊髓损伤后小胶质细胞是损伤区重要的免疫细胞，而调控损伤区小胶质细胞的活化状态有助于促进sci修复，例如shuhei kobashi等人将m2型小胶质细胞移植到动物脊髓损伤模型中，发现其能够抑制炎性反应，促进轴突再生和髓鞘形成。但是，由于脊髓损伤区损伤微环境的影响，移植入的m2型小胶质细胞表型变弱而失去其功能，因此寻找一种能够维持m2型活化表型的途经对修复脊髓损伤显得尤为重要。已有研究证实，利用mirna抑制脊髓损伤区m1型小胶质细胞活化和/或促进m2型小胶质细胞活化，可以降低脊髓损伤区的炎症反应，促进脊髓的修复和脊髓损伤动物的后肢运动功能的恢复(mir-145a-5p修饰的小胶质细胞在脊髓损伤治疗中的作用和机制研究.doi:10.26914/c.cnkihy.2021.070637；第十四届全国免疫学学术大会2021-10-21)，但将其实际应用于临床治疗脊髓损伤还有待进一步研究，尚未解决的问题包括：在脊髓损伤区原位移植后，m2型小胶质细胞表型特征不够显著、存活时间不够长，影响脊髓受损后期运动功能的恢复(bms score仅达到4.5～5，bmssubscore仅达到4～4.5)。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种治疗型小胶质细胞的建立和应用。
2、为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、一种原代小胶质细胞的培养方法，包括以下步骤：
4、1)将仔鼠浸泡于预冷的70％～75％酒精中，待仔鼠失去知觉后取材脑组织；
5、2)将脑组织剪碎成乳糜状后用消化液在35～37℃细胞孵箱中消化15～20min，消化中每5～10min摇晃一次；所述消化液含有0.125％～0.2％的胰酶和0.02％～0.04％的edta；
6、3)终止消化后用吸管反复吹打至少100次，得细胞悬液，用200～300目滤网过滤该细胞悬液中的组织碎片，将经过过滤的细胞悬液离心；
7、4)经过步骤3后，吸弃上层液体，用含10％～15％血清及1％～1.5％谷氨酰胺的培养基重悬细胞；将所得细胞悬液与终浓度为20～30ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，m-csf)在培养瓶中混合，然后将培养瓶置于35～37℃细胞孵箱中培养12～14天，培养期间每隔2～3天更换一次含10％～15％血清及1％～1.5％谷氨酰胺的培养基，并添加终浓度20～30ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子；
8、5)经过步骤4后，将培养瓶置于35～37℃摇床上并在200～250rpm条件下振荡2～4h，振荡后通过离心收集培养上清液中的原代小胶质细胞(具体为m0型小胶质细胞)。
9、优选的，步骤1中，仔鼠选自新生p1～p3 c57小鼠。
10、优选的，步骤1中，取材脑组织具体包括以下步骤：处死仔鼠后取出大脑，选取两侧大脑半球剥除软脑膜，并弃去中间连接两侧大脑半球的胼胝体。
11、优选的，步骤2中，消化液的用量为：每3～5只仔鼠的乳糜状脑组织使用5ml消化液。
12、优选的，步骤3及步骤5中，离心的条件为：在4～6℃、300～350g条件下离心4～5min。
13、上述原代小胶质细胞的培养方法在制备增强脊髓损伤区m2型小胶质细胞表型的mirna制剂中的应用，所述mirna制剂包括mir-145a-5p(guccaguuuucccaggaaucccu)修饰的m2型小胶质细胞，该m2型小胶质细胞是通过对所述培养方法所得原代小胶质细胞进行m2型活化及mirna转染而得到的。
14、优选的，所述mirna制剂还包括用于将mir-145a-5p修饰的m2型小胶质细胞加载于脊髓损伤区的载体。
15、优选的，所述载体包括基质胶。
16、优选的，所述mirna制剂的剂型为注射剂，每2.5～3.5μl mirna制剂中含有2.0～3.0×105个mir-145a-5p修饰的m2型小胶质细胞。
17、优选的，所述mir-145a-5p修饰的m2型小胶质细胞的制备具体包括以下步骤：用巨噬细胞集落刺激因子预处理所述原代小胶质细胞(具体为m0型小胶质细胞)，对预处理后的m0型小胶质细胞用m2极化刺激因子进行活化处理，得到m2型小胶质细胞，将mir-145a-5p转染该m2型小胶质细胞后用巨噬细胞集落刺激因子进行诱导培养，得到mir-145a-5p修饰的m2型小胶质细胞。
18、优选的，所述预处理具体包括以下步骤：将所述原代小胶质细胞(具体为m0型小胶质细胞)接种于细胞培养板中，然后于35～37℃细胞孵箱中培养18～24h，培养中采用含10％～15％胎牛血清的培养基，并添加终浓度20～30ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子。
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1.一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤1中，仔鼠选自新生P1～P3 C57小鼠。
3.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤1中，取材脑组织具体包括以下步骤：处死仔鼠后取出大脑，选取两侧大脑半球剥除软脑膜，并弃去中间连接两侧大脑半球的胼胝体。
4.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤2中，消化液的用量为：每3～5只仔鼠的乳糜状脑组织使用5mL消化液。
5.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤3及步骤5中，离心的条件为：在4～6℃、300～350g条件下离心4～5min。
6.如权利要求1～5中任意一项所述的原代小胶质细胞的培养方法在制备增强脊髓损伤区M2型小胶质细胞表型的miRNA制剂中的应用，其特征在于：所述miRNA制剂包括miR-145a-5p修饰的M2型小胶质细胞，该M2型小胶质细胞是通过对所述培养方法所得原代小胶质细胞进行M2型活化及miR
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述miRNA制剂还包括用于将miR-145a-5p修饰的M2型小胶质细胞加载于脊髓损伤区的载体，所述载体包括基质胶。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述miRNA制剂的剂型为注射剂，每2.5～3.5μL miRNA制剂中含有2.0～3.0×105个miR-145a-5p修饰的M2型小胶质细胞。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述miR-145a-5p修饰的M2型小胶质细胞的制备具体包括以下步骤：用巨噬细胞集落刺激因子预处理所述原代小胶质细胞，对预处理后的原代小胶质细胞用M2极化刺激因子进行活化处理，得到M2型小胶质细胞，将miR-145a-5p转染该M2型小胶质细胞后用巨噬细胞集落刺激因子进行诱导培养，得到miR-145a-5p修饰的M2型小胶质细胞；其中转染的条件为：用添加有转染试剂和100～150mM miR-145a-5p的无血清培养基于35～37℃培养6～8h，转染试剂与miR-145a-5p的容量比为1:2～3。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述预处理具体包括以下步骤：将所述原代小胶质细胞接种后于35～37℃培养18～24h，培养中采用含10％～15％血清的培养基，并添加终浓度20～30ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子；所述诱导培养的条件为：转染结束后用添加有终浓度20～30ng/mL巨噬细胞集落刺激因子且含10％～15％血清的培养基于35～37℃培养18～20h。
...【技术特征摘要】
1.一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤1中，仔鼠选自新生p1～p3 c57小鼠。
3.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤1中，取材脑组织具体包括以下步骤：处死仔鼠后取出大脑，选取两侧大脑半球剥除软脑膜，并弃去中间连接两侧大脑半球的胼胝体。
4.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤2中，消化液的用量为：每3～5只仔鼠的乳糜状脑组织使用5ml消化液。
5.根据权利要求1所述一种原代小胶质细胞的培养方法，其特征在于：步骤3及步骤5中，离心的条件为：在4～6℃、300～350g条件下离心4～5min。
6.如权利要求1～5中任意一项所述的原代小胶质细胞的培养方法在制备增强脊髓损伤区m2型小胶质细胞表型的mirna制剂中的应用，其特征在于：所述mirna制剂包括mir-145a-5p修饰的m2型小胶质细胞，该m2型小胶质细胞是通过对所述培养方法所得原代小胶质细胞进行m2型活化及mirna转染而得到的。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述mirna制剂还包括用于将mir-145a-5p修饰的m2型小胶质细胞加载于脊髓损伤区的载体，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦鸿雁，李鹏辉，王亮，马阳光，陈孛玉，王哲，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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