【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，尤其是涉及通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒及用途。
技术介绍
1、骨髓相关的神经母细胞瘤检测对于诊断高危nb患儿的转移和复发至关重要。然而国内外对nb骨髓复发和转移的标准判断缺乏共识，现有的诊断技术不能解决高危nb患儿的关键性临床难题。现有的骨髓微小诊断技术手段仅基于骨髓涂片的神经母细胞瘤细胞形态学分类技术，而形态学分类技术的敏感性有限且不可靠。此外，浸润性肿瘤细胞的数量无法准确量化，低于0.1％的肿瘤细胞数量几乎无法通过传统的细胞形态学检测出来。研究证实基于gd2靶向的免疫细胞化学染色方法和流式检测方法对nb患儿微小病变的检测灵敏度可达0.001％，可以有效补充现有的骨髓涂片形态学检测方法，但是由于神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶细胞浓度较低，常见于低于102个/ml，基于神经母细胞瘤细胞形态或者表面分子标志检测技术，常出现假阴性，无法实现骨髓mrd精准检测。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在提出通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒及用途，以解决无法实现骨髓mrd精准检测。
2、为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：包括抗cd206抗体。
4、进一步地，包括使用不同荧光素标记的抗cd14抗体和抗cd206抗体。
5、进一步地，所述抗cd14抗体和抗c
6、进一步地，还包括pbs缓冲液。
7、通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒在识别骨髓mrd的用途。
8、通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒的用途，包括如下步骤：
9、s1：枸橼酸钠抗凝骨髓液样品进行稀释、离心，得到单个核细胞层样品；
10、s2：将步骤s1得到的骨髓单个核细胞层样品加入流式管中，在流式管中加入不同荧光素标记的抗cd14抗体和抗cd206抗体，混合后室温避光孵育，加入pbs缓冲液，离心，舍弃上清液，加入pbs缓冲液，得到与荧光抗体结合的单个核细胞样本；
11、s3：对步骤s2得到的单个核细胞样本采用流式细胞仪进行检测，得到cd14和cd206的细胞数及其百分比。
12、步骤s1还包括将采集1小时内新鲜的枸橼酸钠抗凝骨髓液样品先用等体积的生理盐水稀释后再缓慢添加于等体积的淋巴细胞分离液的液面上；经离心，分离出白色絮状层即骨髓单个核细胞层，得到单个核细胞样本；
13、步骤s1还包括对单个核细胞层样品进行体液细胞计数，满足100μl的单个核细胞层能够有1*105个细胞。
14、优选的，离心的条件为，离心机在转速1000～1500rpm下密度梯度离心20min；
15、优选的，枸橼酸钠抗凝骨髓液样品的采集常选骨盆的髂后上棘或髂前上棘。
16、进一步地，所述枸橼酸钠抗凝骨髓液样品的制备包括将抗凝剂与骨髓液按充分混匀，获得枸橼酸钠抗凝骨髓液样品。
17、进一步地，抗凝剂为枸橼酸钠溶液，枸橼酸钠溶液与骨髓液的配比为1：9。
18、进一步地，步骤s2中取100μl的步骤s1所得样本加入流式管中，s1所得样本中至少含有1*105个细胞，室温避光孵育30分钟。
19、通过上述操作获得m2样单核巨噬细胞细胞的数量，在通过抗cd14抗体进行上述实验，对m2样单核巨噬细胞细胞的数量进行计数，判断二者的变化是否显著变化，若发生变化，则存在mrd，若无明显变化，则不存在mrd。
20、相对于现有技术，本专利技术所述的通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒及用途具有以下优势：
21、骨髓中单核-巨噬细胞数目多，可达到105-106个/ml，方便获取和检测。骨髓中m2样单核-巨噬细胞(cd206+monocyte-macrophages)可用于诊断神经母细胞瘤存在骨髓mrd，auc面积高达0.78，而m1样单核巨噬细胞(cd86+monocyte-macrophages)无此诊断价值。同时骨髓m2样单核-巨噬细胞与gd2阳性细胞比例呈正相关。现有技术均基于神经母细胞瘤微小残留病灶细胞检测，细胞数目极少，容易出现假阴性。而本专利申请基于免疫微环境中较多的单核-巨噬细胞极化，辅助诊断神经母细胞瘤存在骨髓mrd。
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1.通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：包括抗CD206抗体。
2.根据权利要求1所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：包括使用不同荧光素标记的抗CD14抗体和抗CD206抗体。
3.根据权利要求1或2所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：所述抗CD14抗体和抗CD206抗体的体积至少为2μl；
4.根据权利要求1或2所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：还包括PBS缓冲液。
5.权利要求1或2所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒在识别骨髓MRD的用途。
6.根据权利要求5所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒的用途，其特征在于：包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒的用途，其特征在于：步骤S1还包括将
8.根据权利要求7所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒的用途，其特征在于：步骤S1中的枸橼酸钠抗凝骨髓液样品的制备包括将抗凝剂与骨髓液按充分混匀，获得枸橼酸钠抗凝骨髓液样品。
9.根据权利要求8所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒的用途，其特征在于：抗凝剂为枸橼酸钠溶液，
10.根据权利要求6所述的通过M2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒的用途，其特征在于：步骤S2中取100μl的单个核细胞样品加入流式管中，其中含有1*105个细胞，加入抗CD14抗体和CD206抗体，室温避光孵育30分钟。
...【技术特征摘要】
1.通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：包括抗cd206抗体。
2.根据权利要求1所述的通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：包括使用不同荧光素标记的抗cd14抗体和抗cd206抗体。
3.根据权利要求1或2所述的通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：所述抗cd14抗体和抗cd206抗体的体积至少为2μl；
4.根据权利要求1或2所述的通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒，其特征在于：还包括pbs缓冲液。
5.权利要求1或2所述的通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒在识别骨髓mrd的用途。
6.根据权利要求5所述的通过m2样巨噬细胞对儿童神经母细胞瘤骨髓微小残留病灶检测的试剂盒的用途，其特征在于：包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈冲，马美静，王浩，白丽萍，
申请(专利权)人：天津市肿瘤医院天津医科大学肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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