【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于生物技术研发领域，具体提供了一种嵌合抗原受体(car)及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell，car-t)免疫疗法疗法是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。car-t细胞疗法通过重新编程免疫系统来对抗肿瘤细胞，而不依赖于hla呈递，t细胞经过基因工程改造，以呈现识别肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，并输注到患者体内。工程化抗体对这些癌症同源特异性抗原的识别会导致t细胞中某些信号传导途径的启动，从而诱导多种促炎细胞因子(如ifn-γ、tnf-α、il-6和il-2)释放和肿瘤细胞的溶解。car-t细胞的这种独特功能可以弥补t细胞受体(tcr)介导的免疫反应的局限性，例如t细胞对抗原的亲和力低以及肿瘤细胞上mhc的缺失。
2、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是一种人工蛋白质，由三个主要成分组成：跨膜结构域、细胞内信号基序和细胞外肿瘤特异性抗体。细胞外肿瘤特异性抗体是抗原靶向的关键组成部分，并包含源自天然肿瘤特异性抗体的单链片段(scfv)(参见srivastava s,riddell sr.engineering car-t cells:design concepts.trendsimmunol.2015；36(8):494-
3、迄今为止，已经开发出五代car。在第一代中，胞内结构域(细胞内信号基序)仅由cd3δ链组成，无法提供足够的t细胞增殖和细胞因子释放。因此在第二代中，添加了细胞内共刺激结构域(cd28或4-1bb)，以改善t细胞增殖和持久性。在第三代中，cd28和4-1bb均已添加到细胞内，以进一步增加t细胞增殖和持久性。在第四代，第二代car的内域中添加了多种细胞因子，例如il-12，可刺激t细胞和自然杀伤细胞针对癌细胞的激活，这些受刺激的自然杀伤细胞可以招募细胞因子，并有助于增加针对癌细胞的细胞毒性，这种结构出现延长了car-t细胞的寿命，并刺激car-t细胞对抗抗原阴性癌细胞和肿瘤微环境。在第五代中，添加了stat3转录因子和il-2受体的结合位点以诱导细胞因子风暴。
4、此外，研究人员尝试应用了多种方法来提高car-t细胞的抗肿瘤功能。临床前模型已经证明，cd28和4-1bb联合共刺激可以增强car-t细胞的持久性、il-2分泌和细胞溶解活性。带有cd40l的修饰t细胞将导致促炎细胞因子的产生和分泌增加，例如干扰素γ(ifnγ)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、il-2和il-12。il-12通过招募和增强巨噬细胞和nk细胞等先天免疫细胞、增加细胞毒性t细胞活化、增加1型辅助t(th1)水平，在car-t细胞的抗癌活性中发挥多种关键作用反应，并减少血管生成活性。近年来，还开发了t细胞重定向通用细胞因子杀伤(truck)方法，truck可以通过产生和分泌外源因子(例如il-12)来重定向car-t细胞，以刺激免疫系统对抗car-t细胞无法识别的癌细胞(参见chmielewski m,hombach aa,abken h.ofcar s and truck s:chimeric antigen receptor(car)t cells engineeredwith an inducible cytokine to modulate the tumor stroma.immunol rev.2014.jan；257(1):83-90)。除了靶向癌症特异性抗原外，car-t细胞还产生ifn-γ细胞因子，该细胞因子通过与肿瘤基质中表达的ifnγ受体(ifnγr)相互作用，在不依赖于抗原的癌细胞破坏中发挥作用。
5、尽管如此，car-t细胞疗法仍面临诸多挑战，包括如下方面：
6、第一，抗原逃逸。虽然最初靶向car-t细胞的单一抗原可以提高反应率，但接受这些car-t细胞治疗的很大一部分患者的恶性细胞表现出部分或完全丧失靶抗原表达，这种现象称为抗原逃逸。例如，虽然70-90％的复发和/或难治性all患者对cd19靶向car-t细胞疗法表现出持久的反应(参见maude sl,teachey dt,porter dl,grupp sa.cd19-targetedchimeric antigen receptor t-cell therapy for acute lymphoblasticleukemia.blood.2015；125:4017–4023)。为了降低car-t细胞治疗血液恶性肿瘤和实体瘤的复发率，现在许多策略都依赖于针对多种抗原，采用双car构建体或串联car，包含两个scfv的单个car构建体，以便同时靶向多个靶肿瘤抗原。
7、第二，car-t细胞运输和肿瘤浸润。与血液恶性肿瘤相比，实体瘤car-t细胞治疗受到car-t细胞运输和浸润实体瘤能力的限制，因为免疫抑制性肿瘤微环境和肿瘤基质等物理肿瘤屏障限制了car的渗透和流动性-t细胞。为改善这些限制，最先想到的策略是利用全身递送以外的递送途径，局部给药消除了car-t细胞运输到疾病部位的需要，限制了靶向肿瘤外毒性，最大限度地减少与正常组织的相互作用。另一种策略是在car-t细胞上表达趋化因子受体，这些受体与肿瘤来源的趋化因子相匹配并对其做出反应，例如研究表明，经过修饰以表达cxcr2的整合素αvβ6-car-t细胞或过度表达cxcr1或cxcr2的car-t细胞均可增强运输并显着提高抗肿瘤功效(参见liu g,et al.cxcr2-modified car-t cells haveenhanced trafficking ability that improves treatment of hepatocellularcarcinoma.eur.j.immunol.2020；50:712–724)。
8、第三，免疫抑制微环境。在肿瘤微环境中，许多驱动免疫抑制的细胞类型可以浸润实体瘤，包括骨髓源性抑制细胞(mdsc)、肿瘤相关巨噬细胞(tam)和调节性t细胞(treg)，这些浸润和肿瘤细胞驱动肿瘤促进细胞因子、趋化因子和生长因子的产生。此外，pd-1或ctla-4等免疫检查点通路可降低抗肿瘤免疫力。car-t细胞疗法无反应或反应弱的主要原因之一是t细胞扩增不良和短期t细胞持久性。因此，研究人员试图设计能够抵抗恶劣肿瘤微环境中免疫抑制因素(如tgfβ介导的抑制信号)的car；还有对car-t细胞进行改造，以刺激性细胞因子的形式提供免疫刺激信号，从而增加t细胞的存活、增殖、抗肿瘤活性，并重新平衡肿瘤微环境；也有研本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向EGFR的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内信号转导域，所述靶向EGFR的scFv包括如SEQ ID NO.1所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域选自以下蛋白质中的一种或几种：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB、CDS、ICAM-1、LFA-1、CLAUDIN、CD278或GITR。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域为4-1BB。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列和如SEQ ID NO.3所示。
5.一种重组细胞，所述重组细胞表达权利要求1-4任一项中所述的嵌合抗原受体，所述重组细胞为经修饰的T细胞。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述T细胞经过IFN-β和IL-35诱导激活。p>
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述诱导激活步骤为在终浓度为50-100ng/mL的IFN-β和10-50ng/mL的IL-35培养基中孵育24-48h。
8.一种权利要求1-4中任意一项所述的嵌合抗原受体和/或权利要求5-7任一项所述的重组细胞在制备治疗实体瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，所述实体瘤包括肝癌、肺癌、骨癌、脑癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、黑色素瘤、肝内胆管癌、卵巢癌、肾癌、胶质瘤、头颈部细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、恶性间皮瘤、甲状腺癌、宫颈癌、神经膀胱癌、前列腺癌。
10.根据权利要求9所述的应用，所述实体瘤为乳腺癌。
...【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向egfr的scfv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内信号转导域，所述靶向egfr的scfv包括如seq id no.1所示的重链可变区氨基酸序列和如seq id no.2所示的轻链可变区氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域选自以下蛋白质中的一种或几种：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、4-1bb、cds、icam-1、lfa-1、claudin、cd278或gitr。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域为4-1bb。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列和如seq id no.3所示。
5.一种重组细胞，所述重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄金勇，张涛，
申请(专利权)人：北京胜元优奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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