【技术实现步骤摘要】
本申请涉及食品医药领域，尤其涉及一种具有血管紧张素转化酶(angiotensinconverting enzyme,ace)抑制作用的蜂王浆活性肽组合物及其制备方法和应用。
技术介绍
1、高血压是以体循坏动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征的临床综合征，可引起心肌梗死、脑卒中和冠状动脉硬化等疾病。全球高血压患者逐年递增，高血压已成为一种重要的世界公共卫生问题。ace是一种广泛存在于肺、睾丸和肾脏中的、含有zn2+辅基的二肽羧肽酶。ace是肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,ras)的一部分，可以将血管紧张素i(asp-arg-val-tyr-ile-his-pro-phe-his-leu)从c末端切除his-leu，转化成血管紧张素ii(asp-arg-val-tyr-ile-his-pro-phe)，而血管紧张素ii可以使小动脉收缩和加速心脏搏动导致血压升高。另一方面，ace也是激肽-激肽释放酶系统的重要组成部分，它可以催化缓激肽成为失活片段，从而加速机体血压升高。因此，抑制ace活性可以降低血压。在临床上通常使用的“普利”类降压药即是利用抑制ace活性达到降血压的目的，然而长期服用这类化学合成降压药会对人体产生一系列的副作用，因此，开发食源蛋白质的ace抑制肽已成为国内外学者研究的热点。
2、目前，已有大量从食源蛋白质酶解制备ace抑制肽的报道。这些食物原料通常富含蛋白质、成本低廉、有特殊的加工需求或是肽产品有极佳的生理活性。蜂王浆(royaljelly)是6d～18d
3、有关蜂王浆蛋白源ace抑制肽的研究还处于起步阶段，目前研究报道较少，大多停留在简单水解条件摸索，还没有商业化开发降血压作用的产品。仅有极少报道从蜂王浆蛋白中分离鉴定出ace抑制肽氨基酸序列的报道，如：toshiro matsui等人采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶水解水解蜂王浆蛋白，再采用复杂的色谱分离方法获得了ile-val-tyr等8种ic50值小于10μm的ace抑制肽。
4、传统的酶解方法包括酶种类的选择、单酶或多酶复合作用研究，酶解条件优化等；如果要分离到纯肽，还需复杂的纯化工艺，尤其是纯化最后一步需要采用分析型色谱柱，才能达到足够的分辨率，且需多次纯化才能获得极微量的纯肽，制备成本极高，不适合工业化生产，只适合科学研究；虽然可以根据获得的纯肽序列，体外合成多肽，但合成法成本目前仍然较高，同样不适用于工业化生产。
5、因此，有必要改进蜂王浆活性肽的传统生产方法。近年来发展迅速的生物信息学技术可为生物大数据分析提供方法和工具，正逐渐应用于生物活性肽的功能研究。生物信息学方法可以分析活性肽的结构和功能关系；预测肽的生物活性；模拟蛋白水解；寻找生物活性肽的潜在前体蛋白；蛋白质和活性肽分子对接等。目前，生物信息学的方法已经在一些活性肽的制备方面开始应用，但是采用该方法应用于蜂王浆活性肽的制备还未见报道。。
技术实现思路
1、为克服现有技术中存在的上述缺陷，本申请提供了一种具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物及其制备方法和应用，以一种蜂王浆水溶性蛋白为原料，采用生物信息学虚拟酶解，筛选适合生产蜂王浆蛋白源的ace抑制肽的酶或酶组合，采用实验验证虚拟酶切的效果，采用凝胶层析、阴离子交换层析和反相c18半制备色谱纯化生产具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物。
2、为了实现上述专利技术目的，本申请提供以下技术方案：
3、一方面，本申请提供了一种具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物，所述蜂王浆活性肽组合物包括5种小分子肽中的至少一种；
4、所述5种小分子肽的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5所示。
5、第二方面，本申请提供了上述具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，包括如下步骤：
6、(1)利用生物信息法虚拟酶解蜂王浆蛋白，制备ace抑制肽酶解物；
7、(2)验证虚拟酶解的效果，并制备ace抑制肽酶解物；
8、(3)将步骤(2)所得ace抑制肽酶解物分离纯化制备所述具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物。
9、可选地，步骤(1)中所述蜂王浆蛋白包括mrjp1、mrjp2和mrjp3；其中，mrjp1在ncbi数据库中蛋白的编号为acs66836.1；mrjp2在ncbi数据库中蛋白的编号为acs66837.1，mrjp3在ncbi数据库中蛋白的编号为adc55524.1。
10、可选地，步骤(1)中所述生物信息法包括：利用biopep数据库中的“proteins”,“analysis”,“calculations”,“profiles of potential biological activity”活性对mrjp1，mrjp2，mrjp3进行生物活性预测；利用biopep数据库中的“proteins”,“analysis”,“enzyme(s)action”功能对mrjp1，mrjp2，mrjp3进行单酶或组合酶虚拟切割，根据酶切后的蛋白质释放的ace活性肽的频率，得到目标酶或酶组合。
11、可选地，所述单酶包括人体内消化道内的胃蛋白酶ec 3.4.23.1、胰蛋白酶ec3.4.21.4、糜蛋白酶a ec3.4.21.1、菠萝蛋白酶ec 3.4.22.32、木瓜蛋白酶ec3.4.22.2、碱性蛋白酶ec 3.4.21.62、蛋白酶kec3.4.21.64中的任意一种；所述组合酶包括糜蛋白酶aec3.4.21.1、菠萝蛋白酶ec 3.4.22.32、木瓜蛋白酶ec3.4.22.2、碱性蛋白酶ec3.4.21.62、蛋白酶kec3.4.21.64中的任意两种。
12、可选地，步骤(2)中所述验证的条件为：
13、1)将蜂王浆水溶性蛋白干粉按8～12％的质量比溶于去离子水中，按照7000～9000μ/g蛋白质的量添加酶，在酶最优的条件下酶解3～6h，得酶解液；
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1.一种具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物，其特征在于，所述蜂王浆活性肽组合物包括5种小分子肽中的至少一种；
2.一种如权利要求1所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述蜂王浆蛋白包括MRJP1、MRJP2和MRJP3；其中，MRJP1在NCBI数据库中蛋白的编号为ACS66836.1；MRJP2在NCBI数据库中蛋白的编号为ACS66837.1，MRJP3在NCBI数据库中蛋白的编号为ADC55524.1。
4.如权利要求2所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述生物信息法包括：利用BIOPEP数据库中的“PROTEINS”,“ANALYSIS”,“CALCULATIONS”,“PROFILES OF POTENTIAL BIOLOGICAL ACTIVITY”活性对MRJP1，MRJP2，MRJP3进行生物活性预测；利用BIOPEP数据库中的“PROT
5.如权利要求4所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，所述单酶包括人体内消化道内的胃蛋白酶EC 3.4.23.1、胰蛋白酶EC3.4.21.4、糜蛋白酶A EC3.4.21.1、菠萝蛋白酶EC 3.4.22.32、木瓜蛋白酶EC3.4.22.2、碱性蛋白酶EC3.4.21.62、蛋白酶KEC3.4.21.64中的任意一种；所述组合酶包括糜蛋白酶A EC3.4.21.1、菠萝蛋白酶EC 3.4.22.32、木瓜蛋白酶EC3.4.22.2、碱性蛋白酶EC 3.4.21.62、蛋白酶KEC3.4.21.64中的任意两种。
6.如权利要求2所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述验证的条件为：
7.如权利要求2所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中的所述酶若为组合酶解，则先按总加酶量的50％添加第一种酶，先调节至第一种酶的最适反应条件进行酶解，酶解2h，然后，按总加酶量的50％添加第二种酶，调节至第二种酶的最适条件继续酶解2h，得酶解液。
8.如权利要求2所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述分离纯化的操作为将步骤(2)所得ACE抑制肽酶解物经过Sephadex G-25柱层析分离，用去离子水洗脱，流速0.5mL/min，在280nm下检测吸光度收集洗脱组分，然后将具有最高ACE抑制活性的组分进一步采用HiTrap DEAE-FF阴离子交换纯化；
9.如权利要求8所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)在所述阴离子交换纯化后进一步包括将具有最高的ACE抑制率的组分采用C18反相高效液相色谱纯化；
10.如权利要求1所述的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物或如权利要去2～9所制备的具有ACE抑制作用的蜂王浆活性肽组合物在制备抑制ACE的药物和/或辅助降压保健食品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物，其特征在于，所述蜂王浆活性肽组合物包括5种小分子肽中的至少一种；
2.一种如权利要求1所述的具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述蜂王浆蛋白包括mrjp1、mrjp2和mrjp3；其中，mrjp1在ncbi数据库中蛋白的编号为acs66836.1；mrjp2在ncbi数据库中蛋白的编号为acs66837.1，mrjp3在ncbi数据库中蛋白的编号为adc55524.1。
4.如权利要求2所述的具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述生物信息法包括：利用biopep数据库中的“proteins”,“analysis”,“calculations”,“profiles of potential biological activity”活性对mrjp1，mrjp2，mrjp3进行生物活性预测；利用biopep数据库中的“proteins”,“analysis”,“enzyme(s)action”功能对mrjp1，mrjp2，mrjp3进行单酶或组合酶虚拟切割，根据酶切后的蛋白质释放的ace活性肽的频率，得到目标酶或酶组合。
5.如权利要求4所述的具有ace抑制作用的蜂王浆活性肽组合物的制备方法，其特征在于，所述单酶包括人体内消化道内的胃蛋白酶ec 3.4.23.1、胰蛋白酶ec3.4.21.4、糜蛋白酶a ec3.4.21.1、菠萝蛋白酶ec 3.4.22.32、木瓜蛋白酶ec3.4.22....
【专利技术属性】
技术研发人员：赵勋能，张健，王彦宁，王树彪，
申请(专利权)人：北京金王健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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