【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析检测，具体涉及一种生物样品的前处理方法和游离氨基酸的检测方法。
技术介绍
1、组成生命体蛋白质的20种氨基酸除了甘氨酸外都具有手性，手性氨基酸分为左旋(l构型)与右旋(d构型)。l-氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，是生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。d-氨基酸作为一种非天然氨基酸，除不能直接参与人体蛋白质的合成外，其理化性质与l-氨基酸类似。d-氨基酸与胃肠道疾病、肾病、肝癌和脑部神经病变等有密切关系。所以急需一种简便可靠的方法用来快速准确的分离并定量生物体内l-氨基酸与d-氨基酸。
2、对于单个l-氨基酸l-aas及其相应的d-对映异构体的对映体分离，常使用的分离技术为气相色谱法、毛细管电泳和液相色谱法(lc)等。其中，lc是生物分析中实现对映体拆分最常用的分离方法，但是其定量的准确度效果不佳。现有的液质联用分离定量手性氨基酸的方法，样品前处理过程中需要先对氨基酸进行衍生化，用间接的方法实现手性氨基酸的分离。然而，不同氨基酸会对衍生化试剂进行竞争性反应，且在衍生化过程中，氨基酸可能会在高温或者极端酸性碱性的环境下消旋损失，导致现有的液质联用分离定量手性氨基酸的方法不能准确定量手性氨基酸。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种生物样品的前处理方法和游离氨基酸的检测方法。本专利技术提供的前处理方法操作简便，无需衍生化，适用于多种手性氨基酸和甘氨酸，经后续的液质联用(lc-ms/m
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种生物样品的前处理方法，当待测生物样品为血清或尿液时，所述前处理方法包括以下步骤：利用5-磺基水杨酸水溶液对待测生物样品进行蛋白沉淀后第一离心分离，将所得上清液进行第一milipore-ultral free过滤器离心分离，所得下清液为待测样品液；
4、当待测生物样品为粪便时，所述前处理方法包括以下步骤：将待测粪便与pbs混合孵育，将所得悬浊样品液进行第二离心分离，将所得上清液进行第二milipore-ultralfree过滤器离心分离，所得下清液为待测样品液。
5、优选的，所述利用5-磺基水杨酸水溶液对待测生物样品进行蛋白沉淀包括：将待测生物样品与5-磺基水杨酸水溶液进行震荡混合后静置；所述震荡混合的时间为5～10min；所述静置的温度为0～4℃，时间为5～10min；所述蛋白沉淀的次数为1～2次。
6、优选的，所述5-磺基水杨酸水溶液的浓度为4～5wt％；
7、所述待测生物样品与单次蛋白沉淀用5-磺基水杨酸水溶液的体积比为1：1～2。
8、优选的，所述尿液在使用前先进行滤膜过滤。
9、优选的，所述悬浊样品液中待测粪便的浓度为0.1～0.2g/ml。
10、优选的，所述混合孵育包括依次进行震荡混合和孵育，所述震荡混合的时间为5～10min，所述孵育的温度为0～4℃，时间为10～15min；所述混合孵育的次数为2～3次。
11、优选的，所述第一离心分离、第二离心分离、第一milipore-ultral free过滤器离心分离和第二milipore-ultral free过滤器离心分离的温度独立地为4～6℃，转速独立地为12000～13800r/min，时间独立地为10～15min。
12、本专利技术提供了一种生物样品中游离氨基酸的检测方法，包括以下步骤：
13、将上述技术方案所述前处理方法制得的待测样品液进行液质联用检测，得到物样品中游离氨基酸的定性检测结果和/或定量检测结果；
14、所述定量检测结果根据内标法和标准曲线得到，所述标准曲线为氨基酸标准品的浓度和峰面积的标准曲线；
15、所述氨基酸包括手性氨基酸和/或甘氨酸；所述手性氨基酸包括l-氨基酸和/或d-氨基酸；所述l-氨基酸包括l-谷氨酸、l-亮氨酸、l-蛋氨酸、l-异亮氨酸、l-缬氨酸、l-苯丙氨酸、l-精氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-苏氨酸、l-天冬酰胺、l-丝氨酸、l-半胱氨酸、l-天冬氨酸、l-组氨酸和l-丙氨酸中的一种或几种；所述d-氨基酸包括d-谷氨酸、d-亮氨酸、d-蛋氨酸、d-异亮氨酸、d-缬氨酸、d-苯丙氨酸、d-精氨酸、d-色氨酸、d-酪氨酸、d-苏氨酸、d-天冬酰胺、d-丝氨酸、d-半胱氨酸、d-天冬氨酸、d-组氨酸和d-丙氨酸中的一种或几种。
16、优选的，所述待测样品液在使用前先利用甲醇水溶液进行定容。
17、优选的，所述液质联用检测包括高效液相检测和质谱检测；
18、所述高效液相检测的条件包括：色谱柱为crownpakcr-i(+)色谱柱；柱温为20～25℃；流动相a为乙醇-水-三氟乙酸混合溶剂，所述乙醇-水-三氟乙酸混合溶剂中乙醇、水和三氟乙酸的体积比为50：50：0.4～0.5；流动相b为乙腈-三氟乙酸混合溶剂，所述乙腈-三氟乙酸混合溶剂中乙腈和三氟乙酸的体积比为100:0.4；流动相流速为0.4ml/min；进样量为1μl；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：0～4min，流动相a体积分数为a为8％，4～4.1min，流动相a的体积分数由8％增加至30％，4.1～10min，流动相a体积分数为a为30％，10～10.1min，流动相a的体积分数由30％降低至8％，10.1～15min，流动相a体积分数为8％；
19、所述质谱检测的条件包括：加热模块的温度为250～300℃，接口的温度为200～250℃，dl管的温度为200℃～250℃，喷雾电压为4.5～5.0kv，雾化气的流速为3.0l/min，干燥气的流速为15l/min，加热气的流速为5l/min，喷针与dl管的间距为3mm，碰撞诱导解离气压力为270kpa。
20、本专利技术提供的前处理方法无需进行衍生化处理，避免了不同氨基酸会对衍生化试剂进行竞争性反应的问题，且未使用酸碱以及采用高温条件进行前处理，避免了氨基酸在高温或者极端酸性碱性的环境下消旋损失，提高了生物样品中游离手性氨基酸和/或甘氨酸的分离效果以及定量检测结果的准确性，适用于谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、组氨酸、丙氨酸和甘氨酸多种氨基酸对映体的同时很好的分离、定性检测以及定量检测，具有普适性。而且，本专利技术提供的前处理方法无需要进行衍生化处理，操作简单，前处理耗时短，前处理效率高。
21、本专利技术采用液质联用检测对待测样品液中的氨基酸进行液质联用(lc-ms/ms)检测，操作简便快速、稳定性高、灵敏度高，能够同时实现对多种氨基酸对映体很好地分离、定性检测和定量检测，为实验研究与临床中手性氨基酸和/或甘氨酸的快速定性和定量检测提供了一种有利的检测方法。
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1.一种生物样品的前处理方法，其特征在于，当待测生物样品为血清或尿液时，所述前处理方法包括以下步骤：利用5-磺基水杨酸水溶液对待测生物样品进行蛋白沉淀后第一离心分离，将所得上清液进行第一Milipore-Ultral free过滤器离心分离，所得下清液为待测样品液；
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述利用5-磺基水杨酸水溶液对待测生物样品进行蛋白沉淀包括：将待测生物样品与5-磺基水杨酸水溶液进行震荡混合后静置；所述震荡混合的时间为5～10min；所述静置的温度为0～4℃，时间为5～10min；所述蛋白沉淀的次数为1～2次。
3.根据权利要求1或2所述的前处理方法，其特征在于，所述5-磺基水杨酸水溶液的浓度为4～5wt％；
4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述尿液在使用前先进行滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述悬浊样品液中待测粪便的浓度为0.1～0.2g/mL。
6.根据权利要求1或5所述的前处理方法，其特征在于，所述混合孵育包括依次进行震荡混合和孵育，所述震
7.根据权利要求1、2、4或5所述的前处理方法，其特征在于，所述第一离心分离、第二离心分离、第一Milipore-Ultral free过滤器离心分离和第二Milipore-Ultral free过滤器离心分离的温度独立地为4～6℃，转速独立地为12000～13800r/min，时间独立地为10～15min。
8.一种生物样品中游离氨基酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品液在使用前先利用甲醇水溶液进行定容。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述液质联用检测包括高效液相检测和质谱检测；
...【技术特征摘要】
1.一种生物样品的前处理方法，其特征在于，当待测生物样品为血清或尿液时，所述前处理方法包括以下步骤：利用5-磺基水杨酸水溶液对待测生物样品进行蛋白沉淀后第一离心分离，将所得上清液进行第一milipore-ultral free过滤器离心分离，所得下清液为待测样品液；
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述利用5-磺基水杨酸水溶液对待测生物样品进行蛋白沉淀包括：将待测生物样品与5-磺基水杨酸水溶液进行震荡混合后静置；所述震荡混合的时间为5～10min；所述静置的温度为0～4℃，时间为5～10min；所述蛋白沉淀的次数为1～2次。
3.根据权利要求1或2所述的前处理方法，其特征在于，所述5-磺基水杨酸水溶液的浓度为4～5wt％；
4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述尿液在使用前先进行滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述悬浊样品液中待测粪便的浓度为0.1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亚峰，查智健，王倩，王瑞华，
申请(专利权)人：山西欧鼎科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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